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    腸炎清對(duì)ICUC大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF—κB蛋白表達(dá)、TLR4mRNA的影響

    2016-11-29 08:22:38黃亦彤鐘志勇呂永慧藍(lán)天美潘競(jìng)鏘
    云南中醫(yī)中藥雜志 2016年9期
    關(guān)鍵詞:潰瘍性結(jié)腸炎

    黃亦彤+鐘志勇+呂永慧+藍(lán)天美+潘競(jìng)鏘+武昕

    摘要:目的通過觀察腸炎清對(duì)免疫復(fù)合潰瘍型結(jié)腸炎模型(ICUC)大鼠結(jié)腸組織Toll樣受體4(TLR 4)和核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響,探討腸炎清治療IBD的作用機(jī)制。方法采用三硝基苯磺酸(TNBS)加免疫復(fù)合法造模。將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、腸炎清低、中、高劑量組(833、1667、3333mL/kg)、柳氮磺吡啶(SASP)組(05g/kg)。造模后第2 d,用藥組分別給予相應(yīng)藥物灌胃7d,給藥7天后麻醉處死大鼠,取新鮮結(jié)腸標(biāo)本,采用免疫組化法檢測(cè)TLR 4、NF-κBp65的表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)TLR 4mRNA的表達(dá)。結(jié)果免疫組化結(jié)果:NF-κBp65和TLR4在各組各只動(dòng)物均可見陽性表達(dá),其中腸炎清高劑量組及SASP組可顯著下調(diào)NF-κBp65的表達(dá),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<005)。TLR4在各給藥組與模型組比較未見顯著差異(P>005)。PCR結(jié)果:與模型對(duì)照組相比,各給藥組大鼠結(jié)腸組織TLR4表達(dá)均為陽性,但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>005)。結(jié)論下調(diào)TLR4、NF-κBp65的表達(dá),是腸炎清治療IBD的作用機(jī)制之一。

    關(guān)鍵詞:腸炎清;潰瘍性結(jié)腸炎;ICUC大鼠;TLR4;NF-κBp65

    中圖分類號(hào):R2855文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1007-2349(2016)09-0072-04

    【Abstract】Objective: To observe the effect of Changyanqing on the colon tissue Toll-like receptor 4 (TLR 4) and nuclear factorκB (NF-κB) expression of immune complexes ulcerative colitis (ICUC) rats and explore its mechanism to treat IBD. Methods: Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) plus immune complex was used to make models. Rats were randomly divided into a control group, a model control group, Changyanqing groups with low, medium and high dose (833, 1667, 3333mL/kg) and sulfasalazine (SASP) group (0.5g/kg). In the following the day after modeling, the treatment groups were administered with corresponding drugs for 7 days, and the rats were sacrificed 7 days later to take their fresh colonic samples. Immunohistochemistry was used to detect TLR 4 and NF-κBp65 expression, and RT-PCR method to detect TLR 4mRNA expression. Results: Immunohistochemical results: NF-κBp65 and TLR4 in each group can be seen positive expression, among which the expression of NF-κBp65 of Changyanqing group with high dose and SASP group could be significantly down-regulated, and there are significant differences (P<005). TLR4 in each treatment group and the model group showed no significant difference (P>005). PCR Results, compared with the model group, TLR4 expressions of the colon tissue of each administration group were positive, but there was no significant difference (P>005). Conclusion: Changyanqing can down-regulate TLR4, NF-κBp65 expression, and its mechanism may be related to the regulation of TLR4 / NF-κB signal pathway.

    【Key words】Changyanqing, ulcerative colitis, ICUC rats, TLR4, NF-κBp65

    屬非特異性的自發(fā)免疫性疾病,病變主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層,臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液血便等。其病因和發(fā)病機(jī)理至今仍不清楚,既往研究認(rèn)為,細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡在IBD的發(fā)生發(fā)展中占有極其重要的地位。近年來不少研究發(fā)現(xiàn),炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子可導(dǎo)致機(jī)體多條信號(hào)通路活化,直接或間接地影響炎癥介質(zhì)的表達(dá),導(dǎo)致腸黏膜受損產(chǎn)生。

    腸炎清是由我院自行研制的純中藥制劑,臨床用于口服和灌腸治療IBD、慢性腹瀉、結(jié)腸息肉電切術(shù)后致腸黏膜受損、腸道菌群失調(diào)及腸功能障礙等。該藥主治以濕熱內(nèi)蘊(yùn)型為多見的腸炎,或兼有脾胃虛弱、氣滯血淤,對(duì)受損腸黏膜有顯著的治療作用。腸炎清[1]經(jīng)結(jié)腸途徑治療,對(duì)UC尤其是輕到中度UC 能夠顯著縮短療程,減少或避免使用激素及SASP,減輕病人的痛苦。腸炎清在動(dòng)物炎癥模型中表現(xiàn)出良好的抗炎效應(yīng)[2-3]。

    本研究采用免疫復(fù)合潰瘍型結(jié)腸炎(ICUC)大鼠模型,通過觀察腸炎清對(duì)ICUC大鼠TLR4、NF-κBp65表達(dá)的影響,探討腸炎清的作用機(jī)制。

    1材料與方法

    11材料

    111實(shí)驗(yàn)藥物腸炎清:廣州市中醫(yī)醫(yī)院自制,2~8℃保存,批號(hào):151128。柳氮磺吡啶腸溶片:上海信誼天平藥業(yè)有限公司,批號(hào):09141109生產(chǎn)日期:20141024;有效期至:201610。

    112動(dòng)物SD大鼠48只,雌性180~200g;SPF級(jí);新西蘭兔,雄性3kg左右;普通級(jí),由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)44007200024500,兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)44411600001758、44411600001799。

    113試劑石蠟:茂名市大川特種蠟廠有限公司。環(huán)保透明劑:上海宏茲實(shí)業(yè)有限公司。無水乙醇、95%乙醇、曙紅(水溶):廣州中南化學(xué)試劑有限公司。蘇木素:GEMADA,Biological Stain Commission,Inc。PBS緩沖液:pH72~76、枸櫞酸鹽緩沖液:pH60,武漢博士德生物工程有限公司。

    NF-κB p65 抗體:Arigo Biolaboratories集團(tuán)公司,TLR4 抗體:羅福斯生物制劑公司,GTVisionTM Ⅲ檢測(cè)系統(tǒng)/Mo&Rb:基因技術(shù)(上海)公司,正常山羊血清:Jackson ImmunoResearch實(shí)驗(yàn)公司,定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix購自Invitrogen公司,

    114儀器TS-12C型生物組織全自動(dòng)脫水機(jī):湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。EG1150型生物組織包埋機(jī):LEICA,德國。RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī):LEICA,德國。CS-VI型攤片烤片機(jī):湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。BX43型生物顯微鏡:OLYMPUS,日本。定量PCR儀:ABI PRISM 7500 Sequence Detection System。

    CellSens Standard顯微圖像軟件:OLYMPUS,日本。Image-Pro Plus version 60圖像分析軟件:Image-Pro 美國。

    12方法

    121模型建立健康SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后建模,造模前禁食24h。:取50g/L TNBS溶液與50%乙醇溶液以體積比1∶1混合配成25g/L三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇溶液;刮取新西蘭兔結(jié)腸黏膜制成組織勻漿,以3000r/min速度離心30min,取上清液,檢測(cè)其蛋白含量并調(diào)節(jié)至20g/L,與等量完全弗氏佐劑混合配成抗原乳化液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    動(dòng)物免疫:模型組大鼠全部于第1天、第14天在大鼠頸、背部注射抗原乳化液(體積為08mL/只動(dòng)物,含抗原8mg)。第21天,所有大鼠禁食不禁水24h,第22天,各組大鼠TNBS乙醇溶液灌腸造模。

    造模方法:大鼠戊巴比妥鈉麻醉,將一直徑20 mm、長(zhǎng)約12 cm的塑膠管由肛門輕緩插入大鼠體內(nèi)深約8cm,按照TNBS 75mg/kg的劑量,03mL/100g體重的給藥體積緩慢注入25g/LTNBS乙醇溶液,然后注入約01mL的空氣,將留在塑膠管內(nèi)的藥物排入腸內(nèi)。給藥完畢,緩慢拔出塑膠管,用手捏住肛門,提起大鼠尾部,持續(xù)倒置1min,使造模劑充分滲入大鼠腸腔內(nèi)??瞻讓?duì)照組注入等量的生理鹽水。驗(yàn)證模型:造模后第2天隨機(jī)選取4只模型組大鼠麻醉后放血處死,剖腹取直腸和結(jié)腸,生理鹽水清洗后肉眼觀察結(jié)腸充血水腫情況,驗(yàn)證模型。

    122動(dòng)物分組及給藥選取40只成模大鼠,隨機(jī)分為5組。造模后第3天各組開始灌胃給藥:腸炎清低、中、高劑量組按照833、1667、3333mL/kg(按照人臨床用量的5、10、20倍折算);SASP組按05g/kg;給藥體積17mL/100g體重,2次/d,連續(xù)7天;空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。

    123標(biāo)本處理末次給藥后24h,戊巴比妥鈉麻醉、放血處死大鼠,開腹,取自肛門向上約10cm結(jié)腸段,沿腸系膜縱軸剪開,生理鹽水沖洗,取一半用4%中性甲醛固定,用于組織病理和免疫組化檢查,另一半液氮速凍,用于PCR檢測(cè)。

    124觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

    1241免疫組化法檢測(cè)TLR4和NF-κBp65表達(dá)組織標(biāo)本經(jīng)取材、固定、修切、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、石蠟切片(防脫)、脫蠟至水、抗原修復(fù)(微波法)、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片。

    每張切片放大400倍隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察,細(xì)胞呈棕黃色為陽性,定位以細(xì)胞核為主。用圖像分析軟件分別測(cè)定各個(gè)視野的平均光密度值,取均值作為每張切片的平均光密度值。

    1242qRT-PCR法檢測(cè)TLR4mRNA表達(dá)[4]Trizol 法提取結(jié)腸組織RNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。樣品1μl,1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA,18s rRNA和28s rRNA條帶,三條條帶完整可證明RNA抽提比較完整。

    逆轉(zhuǎn)錄:RNase free的PCR管中配置溶液Total RNA10μg+H2O總體積12μl,將溶液吹打均勻,置85℃保溫5min,使RNA變性。隨后立即冰上致冷,以防止RNA復(fù)性;在該P(yáng)CR管中加入下列試劑Oligo(dT)15 05μl、Random primer(6-mer)05μl、二者濃度都是10uM、dNTP20μl、RNase inhibitor 05μl、5 x buffer 40μl、M-MLV 05μl總體積80μl。將上述20μl反應(yīng)溶液30℃保溫10min;42℃保溫60min;85℃保溫10min。

    定量PCR:檢測(cè)序列片段。內(nèi)參片段:GAPDH-200bp,目的片段:TLR4-386bp

    引物序列見表1。

    并列表說明,各組數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s),采用SPSS210統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料數(shù)據(jù)若方差齊,則采用單因素方差分析,組間比較用LSD法,若方差不齊,數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊,采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2結(jié)果)PCR表達(dá)結(jié)果(x±s,n=8):空白對(duì)照組:(274±164);模型對(duì)照組:(311±199);腸炎清低劑量組:(249±156);腸炎清中劑量組:(318±185);腸炎清高劑量組:(359±173);SASP組:(362±236)。

    與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)有所增加,但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>005)。與模型對(duì)照組相比,各給藥組大鼠結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)均有不同程度的降低,但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>005)。

    3小結(jié)

    免疫組化法結(jié)果顯示:NF-κB和TLR4在各組各只動(dòng)物均可見陽性表達(dá),具體情況如下:

    NF-κB:主要表達(dá)部位為黏膜層頂端上皮細(xì)胞胞漿、腸腺近腸腔側(cè)上皮細(xì)胞胞漿、黏膜固有層及黏膜下層結(jié)締組織以及炎性細(xì)胞胞漿。模型對(duì)照組表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組。各給藥組較模型對(duì)照組NF-κB表達(dá)下調(diào),腸炎清高劑量組及SASP組NF-κB表達(dá)量顯著低于模型對(duì)照組。

    TLR4:主要表達(dá)部位與NFκB的表達(dá)部位一致,模型對(duì)照組表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組,各給藥組較模型對(duì)照組表達(dá)下調(diào),但未見顯著差異。

    qRT-PCR結(jié)果顯示:造模后動(dòng)物結(jié)腸組織TLR4mRNA的表達(dá)量有所升高,但未見顯著差異。與模型組相較,各給藥組TLR4mRNA表達(dá)均有不同程度的下調(diào),但未見顯著差異。

    4討論

    TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白,主要表達(dá)在參與宿主防御功能的細(xì)胞上。TLR4最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)。其介導(dǎo)炎癥發(fā)生的相關(guān)機(jī)制目前已經(jīng)研究得比較透徹,TLR4識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMPS)并與之結(jié)合,經(jīng)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終導(dǎo)致 NF-κB 的激活,引發(fā)白 細(xì) 胞 介 素-1(IL -1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的釋放,介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。

    TLR4通過兩條經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活 NF-κB:My D88 依賴性和My D88 非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。MyD88 是含有TLR 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白,是TLR 信號(hào)通路的下游信號(hào)因子,在TLR 信號(hào)通路中有關(guān)鍵性的作用[5-6]。其結(jié)構(gòu)上有3 個(gè)功能區(qū)域:N 端的死亡區(qū)(deathdomain,DD);與Toll 樣受體同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合的羧基末端及C 端的類似于IL-1 受體胞質(zhì)區(qū)的Toll 區(qū)。DD與白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶(interleukon-1 receptorassociated kinase,IRAK)的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合,并引起IRAK 的自身磷酸化,再經(jīng)過一系列的激活反應(yīng),最終引起I-κB 的活化,導(dǎo)致NF-κB 的激活和轉(zhuǎn)位,造成炎性細(xì)胞因子的合成與釋放,從而誘發(fā)機(jī)體本身的炎癥反應(yīng)過程。

    NF-κB在UC的發(fā)生、發(fā)展中是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn),在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用[7]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)各種與UC相關(guān)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8可通過啟動(dòng)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子誘發(fā)或加劇機(jī)體的炎癥反應(yīng)[8]。NF-κB的激活導(dǎo)致TNF-α、IL-1β轉(zhuǎn)錄增加,而TNF-α、IL-1β的釋放又進(jìn)一步激活NF-κB。后者通過正反饋進(jìn)一步增加TNF-α、IL-1β的分泌,同時(shí)使IL-6和IL-8等的表達(dá)亦增加。由此產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),使炎癥不斷放大,形成“瀑布效應(yīng)”。有研究表明[9]應(yīng)用NF-κB抑制劑能改變患者的炎癥狀態(tài)。

    本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,腸炎清對(duì)TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)、TLR4mRNA表達(dá)出現(xiàn)不同程度下調(diào),其中,腸炎清高劑量組與SASP組顯著下調(diào)NF-κBp65表達(dá),證明腸炎清高劑量組與SASP組一樣,對(duì)ICUC大鼠可以抑制炎癥反應(yīng),減少結(jié)腸黏膜損傷。

    由此判斷,下調(diào)TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)、TLR4mRNA表達(dá),是腸炎清的作用機(jī)制之一。但要明確腸炎清治療IBD的作用靶點(diǎn),還需要做更為深入和全面的研究。

    參考文獻(xiàn):

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