槐花對(duì)照提取物的制備及槐花中4個(gè)黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定

皮文霞 趙文望 蔡寶昌 陸兔林 郁紅禮

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）19-2652-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.14

摘 要 目的：制備槐花對(duì)照提取物，并以其為對(duì)照測(cè)定槐花中4個(gè)黃酮類(lèi)成分含量。方法：用水提法制備槐花對(duì)照提取物；采用高效液相色譜法測(cè)定其中蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素的含量；色譜柱為Diamonsil C18（2），流動(dòng)相為甲醇-1%冰乙酸水溶液（梯度洗脫），檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。以槐花對(duì)照提取物為對(duì)照測(cè)定槐花中4個(gè)成分的含量，并與以化學(xué)對(duì)照品為對(duì)照的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：在所制槐花對(duì)照提取物中，4個(gè)成分的含量占86.85%；蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.076 8～3.07、0.002 24～0.089 6、0.001 59～0.063 7、0.003 40～ 0.136 μg（r均≥0.999 5）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤2.30%（n=6），加樣回收率分別為100.4%、96.99%、102.3%、100.9%（RSD分別為2.51%、1.58%、2.97%、3.20%，n=6）。兩種方法中4個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：以制備的槐花對(duì)照提取物為對(duì)照建立的測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，并能同時(shí)測(cè)定槐花中4個(gè)成分的含量，可用于槐花飲片的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 槐花；對(duì)照提取物；制備；高效液相色譜法；黃酮類(lèi)成分；含量測(cè)定

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare reference extract of Sophora japonica and used it as reference substance to determine the contents of 4 flavonoids in S. japonica. METHODS： The reference extract of S. japonica was prepared by water extraction. HPLC method was adopted to determine the contents of rutin， kaempferol-3-O-rutinoside， narcissoside and quercetin. The determination was performed on Diamonsil C18（2） column with mobile phase consisted of methanol-1% acetic acid （gradient elution）. The detection wavelength was set at 360 nm， the column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. The contents of 4 components in S. japonica were determined by using reference extract of S. japonica as reference， and compared with the results with chemical control as reference. RESULTS： In prepared reference extract of S. japonica， the contents of 4 components were 86.85%. The linear range was 0.076 8-3.07 μg for rutin， 0.002 24-0.089 6 μg for kaempferol 3-O-rutinoside， 0.001 59-0.063 7 μg for narcissoside and 0.003 40-0.136 μg for quercetin （all r≥0.999 5）. RSD of precision， stability and reproducibility tests were all ≤2.30% （n=6）. The recoveries were 100.4%， 96.99%， 102.3% and 100.9%（RSD were 2.51%， 1.58%， 2.97%， 3.20%， n=6）， respectively. There was no statistical significance in the content determination of 4 components between 2 kinds of methods （P>0.05）. CONCLUSIONS： Using prepared reference extract of S. japonica as reference， established method is simple and reproducible， and can be used for simultaneous determination of 4 components in S. japonica and quality control of S. japonica decoction piece.

KEYWORDS Sophora japonica； Reference extract； Preparation； HPLC； Flavonoids； Content determination

對(duì)照提取物是三大類(lèi)中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中藥化學(xué)對(duì)照品、對(duì)照藥材、對(duì)照提取物）之一，為非單體成分的對(duì)照物[1-3]。2015年版《中國(guó)藥典》（四部）收載了21個(gè)對(duì)照提取物[4]。針對(duì)化學(xué)對(duì)照品研制困難、分離難度大、單體不穩(wěn)定、檢測(cè)成本高等問(wèn)題，對(duì)照提取物以其制備成本低、可進(jìn)行多組分檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)而具有較廣闊的應(yīng)用前景[5-7]。

槐花為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花及花蕾。夏季花開(kāi)放或花蕾形成時(shí)采收，及時(shí)干燥，除去枝、梗及雜質(zhì)；開(kāi)放者習(xí)稱(chēng)“槐花”，花蕾習(xí)稱(chēng)“槐米”；其性苦，微寒；歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血、清肝瀉火的功效。主治便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝熱目赤、頭痛眩暈等癥[8]?；被êS酮類(lèi)成分，主要包括蘆丁 （含量達(dá)8%～20%）、槲皮素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（又稱(chēng)水仙苷）及鞣質(zhì)等，此外還含有皂苷類(lèi)、甾體類(lèi)等多種成分[9-11]。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中僅將蘆丁作為槐花的含量檢測(cè)指標(biāo)[8]，不能全面反映其質(zhì)量。本課題組先制備了槐花對(duì)照提取物，并以此為對(duì)照，同時(shí)測(cè)定了槐花飲片中蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素4個(gè)黃酮類(lèi)成分的含量，同時(shí)與以化學(xué)對(duì)照品為對(duì)照的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，為采用對(duì)照提取物法對(duì)槐花飲片進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695高效液相色譜（HPLC）儀、2998二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

槐花飲片（批號(hào)：140501、140601、140602、140603、140701、140702、140703）由安徽泰源中藥飲片有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為豆科植物槐的干燥花及花蕾；蘆?。ㄅ?hào)：MUST-14102301）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)：MUST-14110508）、水仙苷（批號(hào)：MUST-14021713）對(duì)照品均購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司（純度：均≥98%）；槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-200907，純度：≥98%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純（上海申博化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 槐花對(duì)照提取物的制備

取槐花飲片（批號(hào)：140501）5 g，打粉，過(guò)2號(hào)篩。分別以15、10、10倍樣品質(zhì)量的水煎煮提取60、30、30 min。第1次須待水沸騰后加入槐花，注意補(bǔ)充水分。用脫脂棉濾過(guò)，合并3次濾液，濃縮至50 mL，放冷待沉淀析出。過(guò)濾，用純水潤(rùn)洗沉淀3次，抽干。再用50 mL熱水溶解沉淀，趁熱過(guò)濾，放冷析出沉淀，取沉淀并移至蒸發(fā)皿中，60 ℃蒸干，得對(duì)照提取物（0.075 g）。

2.2 槐花對(duì)照提取物中4個(gè)成分的定量分析

以蘆丁、水仙苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素化學(xué)對(duì)照品為對(duì)照，測(cè)定提取物中4個(gè)黃酮類(lèi)成分的含量。

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為甲醇、 B為1%冰乙酸水溶液，梯度流脫（0～15 min，35%→45%A；15～25 min，45%→60%A；25～30 min，60%→35%A）；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，取“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣分析，待測(cè)成分峰理論板數(shù)均不小于4 000，各峰間分離度均大于1.5。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素對(duì)照品1.13、1.22、1.23 mg，各用甲醇定容于10 mL量瓶中；另稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品6.06 mg置于25 mL量瓶中。精密吸取已定容的山柰酚-3-O-蕓香糖苷1.78 mL、水仙苷0.936 mL、槲皮素2.57 mL，用甲醇定容于含蘆丁的25 mL量瓶中，制成混合對(duì)照品溶液，作為母液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取減壓干燥至恒質(zhì)量的槐花對(duì)照提取物約5 mg，精密稱(chēng)定，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.4 線性關(guān)系與定量限考察 精密量取混合對(duì)照品溶液5 mL，用甲醇定容至25 mL，再用甲醇分別稀釋1、2、5、10、20、40倍，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素的回歸方程分別為y=19 504x+ 1 632（r=0.999 7）、y=18 386x-1 045.5（r=0.999 5）、y=22 119x-1 135（r=0.999 5）、y=47 456x-7 843.9（r=0.999 8），表明4種成分的進(jìn)樣量線性范圍分別為0.060 5～2.42、0.002 01～0.080 5、0.001 14～0.045 7、0.003 15～0.126 μg。取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液倍比稀釋至一系列的低質(zhì)量濃度后進(jìn)樣分析，記錄4個(gè)成分的信噪比為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素的定量限依次為6.21、0.21、0.12、0.32 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一份混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面積的RSD分別為0.68%、3.69%、2.05%、1.34%（n=6）。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面積的RSD分別為0.88%、2.65%、3.08%、1.38%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱(chēng)取槐花對(duì)照提取物6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面積的RSD分別為0.38%、1.34%、3.13%、1.21%（n=6），表明該法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 采用空白加樣回收方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素的平均回收率分別為99.90%、98.62%、102.30%、95.81%，RSD分別為3.22%、2.24%、1.97%、1.42%（n=6）。

2.2.9 槐花對(duì)照提取物的標(biāo)定 取槐花對(duì)照提取物約5 mg，共3份，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果，4個(gè)成分含量占槐花對(duì)照提取物質(zhì)量的86.85%?；被▽?duì)照提取物中4個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 采用對(duì)照提取物-HPLC法測(cè)定槐花飲片中4個(gè)成分的含量

2.3.1 槐花對(duì)照提取物溶液的制備 精密稱(chēng)取已標(biāo)定含量的槐花對(duì)照提取物9.75 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照提取物溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 分別稱(chēng)取6個(gè)不同批次的槐花飲片（批號(hào)：140601、140602、140603、140701、140702、140703）粗粉（過(guò)2號(hào)篩）約0.2 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)質(zhì)量；超聲（功率：250 W，頻率：25 kHz）30 min，放冷；再稱(chēng)質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.3 線性關(guān)系與定量限考察 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下的槐花對(duì)照提取物溶液5 mL，用甲醇定容于25 mL量瓶中；再分別量取“2.3.1”項(xiàng)下的槐花對(duì)照提取物溶液5、1、0.5、0.25 mL，各置于10 mL量瓶中，加甲醇搖勻，定容至刻度，配成系列質(zhì)量濃度溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、相應(yīng)的對(duì)照提取物中4個(gè)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素的回歸方程分別為y=21 166x-48 439（r=0.999 6）、y=23 871x-4 366.4（r=0.999 5）、y=23 258x-3 232.2（r=0.999 5）、y= 56 071x-11 209（r=0.999 8），表明蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素進(jìn)樣量線性范圍分別為0.076 8～3.07、0.002 24～0.089 6、0.001 59～0.063 7、0.003 40～0.136 μg。取槐花對(duì)照提取物溶液，倍比稀釋至一系列的低質(zhì)量濃度，吸取10 μL注入色譜儀，記錄4個(gè)成分的信噪比為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度。結(jié)果，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素的定量限依次為7.81、0.25、0.17、0.36 μg/mL。

2.3.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收試驗(yàn) 按“2.2.5～2.2.8”項(xiàng)下相關(guān)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果， 在精密度試驗(yàn)中，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面積的RSD分別為0.55%、1.61%、1.89%、0.68%（n=6）；在穩(wěn)定性試驗(yàn)（24 h）中，4個(gè)成分峰面積值的RSD分別為0.43%、1.70%、2.30%、0.83%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；在重復(fù)性試驗(yàn)中，4個(gè)成分峰面積的RSD分別為1.34%、2.12%、1.58%、1.56%（n=6）；在加樣回收試驗(yàn)中，4個(gè)成分的平均回收率分別為100.40%、96.99%、102.30%、100.90%，RSD分別為2.51%、1.58%、2.97%、3.20%（n=6）。

2.3.5 樣品含量測(cè)定 取6批槐花飲片（批號(hào)：140601、140602、140603、140701、140702、140703）粗粉，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算4個(gè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2，槐花飲片供試品（批號(hào)：140601）溶液色譜圖見(jiàn)圖2。

將以對(duì)照提取物法為對(duì)照測(cè)定的6批槐花飲片中的4個(gè)成分含量與以化學(xué)對(duì)照品為對(duì)照測(cè)定的結(jié)果，采用SPSS 17.0行配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果，6批樣品中，蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素對(duì)應(yīng)的P分別為0.380、1.181、0.859、0.135，均>0.05，顯示二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明可以對(duì)照提取物為對(duì)照對(duì)槐花飲片進(jìn)行質(zhì)量控制。

3 討論

槐花的主要活性成分是黃酮類(lèi)化合物，故本試驗(yàn)在對(duì)照提取物的制備中選取了化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定、便于提取分離且含量較高的4個(gè)黃酮類(lèi)成分（蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷和槲皮素）作為指標(biāo)成分。研究結(jié)果表明，以對(duì)照提取物為對(duì)照的測(cè)定結(jié)果與以化學(xué)對(duì)照品為對(duì)照所測(cè)定的含量結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在槐花飲片的4個(gè)被測(cè)成分中，除蘆丁和槲皮素外，另2個(gè)成分的化學(xué)對(duì)照品供應(yīng)量較少且售價(jià)較高，而槐花對(duì)照提取物的制備和應(yīng)用將解決此類(lèi)單體對(duì)照品分離難度大、成本較高等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)中藥多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制[12-14]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，以槐花對(duì)照提取物為對(duì)照建立的測(cè)定法的主要優(yōu)點(diǎn)有：（1）對(duì)照提取物分離難度小，價(jià)格低廉，便于大量制備；（2）對(duì)照提取物含多個(gè)成分，類(lèi)似于混合對(duì)照品，具備定性指紋圖譜的特征，可簡(jiǎn)化研究?jī)?nèi)容，提高工作效率；（3）減少了相對(duì)昂貴的單一化學(xué)對(duì)照品的使用，節(jié)約了研究成本。此對(duì)照提取物若要實(shí)現(xiàn)商品化，研究工作還有待進(jìn)一步完善，如進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)和放大試驗(yàn)等。

在以多指標(biāo)質(zhì)量控制為趨勢(shì)的中藥研究的大環(huán)境下，對(duì)照提取物具有較大的發(fā)展應(yīng)用潛力。以對(duì)照提取物為對(duì)照的方法雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，但目前在國(guó)內(nèi)的研究仍處于起步階段，尚存在品種少、缺乏明確的規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題，亟待進(jìn)一步加大研究力度與設(shè)定相關(guān)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，為中藥的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)[15-16]。

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（收稿日期：2018-05-02 修回日期：2018-07-02）

（編輯：劉 萍）