異種去細(xì)胞肌腱的制備及其生物相容性的實(shí)驗研究

李軍　徐寶成　王茂榮　伍盛為

【摘要】 目的 分析異種去細(xì)胞肌腱的制備及其生物相容性的實(shí)驗研究。方法 選取3只健康家豬， 并進(jìn)行選擇性的去細(xì)胞異種皮， 同時選取成年Wistar大鼠70只與成年SD大鼠5只， 進(jìn)行選擇性的去細(xì)胞異種皮， 并在術(shù)后進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果 對選擇性去細(xì)胞異種皮與組織學(xué)進(jìn)行觀察后得知， 大體觀察表現(xiàn)為表皮層較為連續(xù)完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟；進(jìn)行皮下植入實(shí)驗后得知， 對其進(jìn)行大體觀察后顯示實(shí)驗動物手術(shù)順利完成， 術(shù)后活動良好， 手術(shù)切口無腫脹、滲液滲出等情況。結(jié)論 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污劑制備選擇性去細(xì)胞異種皮具有良好的生物相容性與形態(tài)學(xué)優(yōu)勢， 可有效修復(fù)大面積深度燒傷的創(chuàng)面， 臨床意義顯著。

【關(guān)鍵詞】 生物相容性；異種去細(xì)胞肌腱；制備；實(shí)驗

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.28.195

對于大面積深度燒傷的患者來說， 其自體皮源十分匱乏， 目前臨床上較為有效的一類治療方案為自體微粒皮移植手術(shù)[1]。其中選擇性去細(xì)胞異種皮可幫助患者誘導(dǎo)細(xì)胞生長分化， 并有效保護(hù)創(chuàng)面， 將該項技術(shù)用于修復(fù)深度燒傷創(chuàng)面患者的臨床意義顯著。本次研究采取動物實(shí)驗方案， 并取得了十分顯著的應(yīng)用效果， 具體報告如下。

1 材料與方法

1. 1 動物與主要試劑 選取3只健康白色家豬， 平均體重（76±8）kg， 成年Wistar大鼠70只， 平均體重（252±14）g， 成年SD大鼠5只， 平均體重（258±12）g， 主要試劑包括25%的戊二醛、胰蛋白酶、小鼠成纖維細(xì)胞等。

1. 2 實(shí)驗方法

1. 2. 1 將家豬處死后去毛， 并將大張全厚皮剝離后去除脂肪， 將戊二醛稀釋至0.1%， 對表皮面連續(xù)固定60 min， 反復(fù)沖洗后削為0.4～0.8 mm厚的斷層皮片， 并采用新潔爾滅連續(xù)浸泡15 min， 采用生理鹽水反復(fù)進(jìn)行清洗， 給予0.25%的胰蛋白酶消化30 min（37℃）， 并置入TritonX-100溶液內(nèi)持續(xù)進(jìn)行震蕩24 h， 將其反復(fù)進(jìn)行沖洗后置入冰箱內(nèi)（4℃）保存， 并將包含慶大霉素的生理鹽水連續(xù)浸泡24 h， 并且每隔6 h換取1次液體， 將其進(jìn)行封裝、輻照消毒并保存。對表皮的保留情況、皮片顏色、質(zhì)地等進(jìn)行嚴(yán)密觀察， 將選擇性去細(xì)胞異種皮置于甲醛溶液內(nèi)（4%）進(jìn)行固定， 并用石蠟進(jìn)行包埋、切片、HE染色處理等， 對表皮結(jié)構(gòu)、纖維變化情況等進(jìn)行嚴(yán)密觀察， 同時將新鮮的豬皮進(jìn)行對照觀察。

1. 2. 2 5只成年SD大老鼠， 在手術(shù)前24 h對背部進(jìn)行備皮處理， 將氯胺酮與速眠新進(jìn)行混合后對腹腔進(jìn)行注射麻醉處理， 并在大鼠的背部切取全層皮膚， 將其置于生理鹽水內(nèi)備用。70只成年Wistar大鼠， 依據(jù)背部皮下植入材料的不同分為1組、2組、3組， 其中1組選擇性去細(xì)胞異種皮， 2組植入新鮮的豬皮， 3組植入大鼠的異體皮， 并在術(shù)前的24 h選擇背部備皮， 將全層的皮膚切開， 將皮下組織進(jìn)行分離后制備皮下囊， 并植入皮片內(nèi)對切口進(jìn)行縫合處理， 手術(shù)完成后的1、2、4、8、12、16周將大鼠的皮膚切開進(jìn)行觀察， 觀察大鼠的皮片與周圍組織的粘連情況， 并進(jìn)行HE染色處理， 對移植區(qū)域的炎性反應(yīng)程度與新生血管、纖維基質(zhì)細(xì)胞長入情況進(jìn)行觀察分析。

對其進(jìn)行炎性反應(yīng)分級， 分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。其中Ⅰ級表示試樣的周圍無淋巴細(xì)胞或者極少量的淋巴細(xì)胞；Ⅱ級表示表示出現(xiàn)少量的淋巴細(xì)胞；Ⅲ級表示出現(xiàn)少量的中性粒細(xì)胞、巨細(xì)胞反應(yīng)、淋巴細(xì)胞浸潤等；Ⅳ級表示試樣周圍伴有以中性粒細(xì)胞浸潤為主的炎性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2. 1 對選擇性去細(xì)胞異種皮與組織學(xué)進(jìn)行觀察后得知， 大體觀察表現(xiàn)為表皮層較為連續(xù)完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟。

2. 2 進(jìn)行皮下植入實(shí)驗后得知， 對其進(jìn)行大體觀察后顯示實(shí)驗動物手術(shù)順利完成， 術(shù)后活動良好， 手術(shù)切口無腫脹、滲液滲出等情況。

3 討論

進(jìn)行微粒皮移植時， 需要采取暫時性的覆蓋物進(jìn)行保護(hù)， 較為常見的覆蓋物包括新鮮豬皮與異體皮， 其中異體皮可以使得大面積燒傷的治愈率得到明顯的提高， 臨床應(yīng)用價值顯著， 但是關(guān)于異體皮的來源受限較多， 且對于傳播病變的微生物可能性難以進(jìn)行徹底的消除， 所以說， 其臨床應(yīng)用受限[2]。而新鮮的豬皮具有價格經(jīng)濟(jì)、來源廣泛等特點(diǎn)， 但是發(fā)生移植后將出現(xiàn)較早時間的排斥反應(yīng)， 并且當(dāng)創(chuàng)面愈合后優(yōu)于真皮取法將使得功能于外觀均不佳。因此， 針對上述問題， 本次研究提出選擇性去細(xì)胞異種皮的概念， 并將其與自體微粒皮進(jìn)行有效結(jié)合， 將其覆蓋深度的燒傷創(chuàng)面將得到較為顯著的應(yīng)用效果。

本次研究選擇戊二醛-胰蛋白酶-去污劑進(jìn)行進(jìn)行選擇性去細(xì)胞異種皮實(shí)驗， 相比以往的臨床研究得知， 其中戊二醛的濃度有所下降， 同時胰蛋白酶的作用時間縮短， 將戊二醛作用于表皮面可以助于滲入表皮層， 并產(chǎn)生氨基酸殘基反應(yīng)， 使得膠原分子能夠與氨基酸側(cè)鏈產(chǎn)生交聯(lián)作用， 將抗原部位進(jìn)行有效遮蔽， 使得膠原分子之間的穩(wěn)定性與張力有所提高。其中胰蛋白酶抗原溶解部分真皮層的基質(zhì)， 使得細(xì)胞間隙較為疏松， 并幫助破壞細(xì)胞的完整性， 使得胰蛋白酶作用時間縮短， 利于將表皮結(jié)構(gòu)完整進(jìn)行保留。而非離子型表面活性劑可以與細(xì)胞膜磷脂進(jìn)行結(jié)合， 并達(dá)到去污、脫細(xì)胞的效果[3， 4]。

本次研究結(jié)果顯示， 對選擇性去細(xì)胞異種皮大體觀察表現(xiàn)為表皮層較為連續(xù)完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟；進(jìn)行皮下植入實(shí)驗后得知， 實(shí)驗動物手術(shù)順利完成， 術(shù)后活動良好， 手術(shù)切口無腫脹、滲液滲出等情況。

綜上所述， 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污劑制備選擇性去細(xì)胞異種皮具有良好的生物相容性與形態(tài)學(xué)優(yōu)勢。

參考文獻(xiàn)

[1] 聶繼平， 溫樹正， 白志剛， 等. 去細(xì)胞異種肌腱復(fù)合IGF-Ⅰ修復(fù)肌腱缺損的實(shí)驗研究. 中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）， 2013， 7（17）：95-99.

[2] 王卉麗. 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）親和肽綁定膠原支架促進(jìn)豬急性全層創(chuàng)面愈合的研究. 南京大學(xué)， 2014.

[3] 陳元良. 異種脫細(xì)胞肌腱鼻充填材料的生物相容性研究. 南方醫(yī)科大學(xué)， 2012.

[4] 武龍. 小腸黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備及其對肝組織損傷修復(fù)的影響. 蘇州大學(xué)， 2015.

[收稿日期：2016-09-21]