桃果實(shí)ζ—胡蘿卜素脫氫酶基因克隆及表達(dá)分析

梁敏華 楊震峰 蘇新國 宋春波

摘要：【目的】克隆桃果實(shí)ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因（PpZDS）的全長序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)分析，為研究桃果實(shí)類胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)理提供參考?！痉椒ā繌狞S肉品種桃果實(shí)中克隆PpZDS基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在桃果實(shí)不同成熟期的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】克隆獲得的PpZDS基因全長2014 bp，具有完整的編碼區(qū)，長度為1716 bp，編碼571個(gè)氨基酸。PpZDS蛋白含有ZDS特征序列（KVAIIGAGLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR），屬于NAD_binding_8超級家族保守結(jié)構(gòu)域。PpZDS蛋白與同為薔薇目的蘋果（gi|33313474）和草莓（gi|256041892）的ZDS蛋白親緣關(guān)系較近，物種間分化程度較小。整個(gè)桃果實(shí)成熟期PpZDS基因在果肉和果皮中均有表達(dá)，從軟核期至硬熟期均呈逐漸升高趨勢，硬熟期達(dá)最高，完熟期降低；不同桃果實(shí)發(fā)育期果肉中的PpZDS基因表達(dá)量均大于果皮中表達(dá)量，其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果實(shí)中PpZDS基因在果肉中的表達(dá)量顯著高于果皮中的表達(dá)量（P<0.05）?！窘Y(jié)論】PpZDS基因表達(dá)對桃果實(shí)類胡蘿卜素生物合成及呈色發(fā)揮正向調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 桃；果實(shí)；ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）；基因克隆；成熟期；表達(dá)分析

中圖分類號： S662.103.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）05-0825-07

Abstract：【Objective】Full-length sequence of ζ-carotene desaturase（PpZDS） gene in peach fruit was cloned and its bioinformatics analysis and expression analysis were also conducted to provide reference for the study of biosynthetic molecular mechanism of carotene organisms in peach fruits. 【Method】PpZDS gene in peach fruit from yellow peach variety was tested and its bioinformatics analysis was carried out. Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）was used to test its expression in different developmental stages. 【Result】The cloned gene PpZDS was 2014 bp in full length， it contained complete coding region of 1716 bp， and encoded 571 amino acids. PpZDS protein contained the characteristic sequence of ZDS（KVAIIGAGLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR）， which belonged to the NAD_binding_8 super familyconserved domains. PpZDS protein showed close genetic relationship with ZDS protein in apple（gi|33313474）and strawberry（gi|256041892）which belonged to Rosales order and differentiation degree between different species was low. Gene PpZDS showed expression in both flesh and peel during whole peach fruit maturation period， and the expression showed a tendency of gradual increase from soft-core stage to firm-ripe stage，reaching the highest at firm-ripe stage，and then decreased at full ripe stage. The expression of gene PpZDS in the fresh was generally higher than that in the peel at different maturation periods. When peach fruit was at firm-core stage， firm-ripe stage and full ripe stage，expression of gene PpZDS in the fruit fresh was significantly higher than the expression in the peel（P<0.05）. 【Conclusion】The expression of gene PpZDS can be involved in the positive regulation of peach fruit carotenoid biosynthesis and color appearance

Key words： peach； fruit； ζ-carotene desaturase（ZDS）； gene cloning； maturation period； expression analysis

0 引言

【研究意義】桃（Prunus persica L.）為薔薇科梅屬多年生大型木本植物，其果實(shí)色、香、味俱全，營養(yǎng)豐富，根據(jù)桃果肉顏色，可分為白肉品種、黃肉品種和紅肉品種。黃肉品種桃果實(shí)中的主要色素成分為類胡蘿卜素（Caprioli et al.，2009），其活性組分為番茄紅素、β-胡蘿卜素和β-隱黃素等，對降低癌癥和心血管疾病發(fā)病率、減少黃斑變性、預(yù)防白內(nèi)障等具有積極作用（Sharoni et al.，2012；Meyers et al.，2014）。因此，深入了解桃果實(shí)中類胡蘿卜素的生物合成規(guī)律及調(diào)控機(jī)制對黃肉桃新品種選育及果實(shí)貯藏加工具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物類胡蘿卜素生物合成的中間產(chǎn)物（牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸、八氫番茄紅素、ζ-胡蘿卜素和番茄紅素），分別由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶和ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）等催化完成（高慧君等，2015）。其中，ζ-胡蘿卜素在ZDS的催化作用下生成鏈孢紅素，經(jīng)脫氫反應(yīng)生成番茄紅素（Breitenbach and sandmann，2005；Pogson et al.，2008）。ZDS作為類胡蘿卜素生物合成途徑中的重要限速酶，其基因表達(dá)分析與蛋白功能鑒定已成為研究熱點(diǎn)。Cong等（2010）研究表明，ZDS在小麥花絮中活性較高，在根部和種子中檢測不到活性，但是否存在ZDS的催化反應(yīng)尚待進(jìn)一步研究。Yan等（2011）、Araya-Garay等（2014）研究表明，不同植物ZDS的氨基酸序列同源性較高，N端含有一個(gè)二核苷酸結(jié)合域，可能與ZDS特異性催化功能有關(guān)。Avendano-Vazquez等（2014）研究表明，抑制擬南芥植株中ZDS活性會(huì)導(dǎo)致β-胡蘿卜素和葉黃素含量降低。Li等（2017）研究表明，在轉(zhuǎn)基因甘薯植株中ZDS基因表達(dá)誘導(dǎo)了β-胡蘿卜素和葉黃素的合成積累，提高了植株的耐鹽特性。Sun等（2018）研究表明，ZDS基因在芥藍(lán)不同發(fā)育階段的組織器官中均有表達(dá)，其中在芽期和幼苗期表達(dá)水平較低，在成熟期表達(dá)水平顯著升高，且ZDS基因在芥藍(lán)葉子中的表達(dá)水平顯著高于其他組織器官。此外，ZDS基因的表達(dá)在柑橘（Kato et al.，2004）、李子（Marty et al.，2005）、奇異果（Ampomah-Dwamena et al.，2009）、番木瓜（Yan et al.，2011）、葡萄（Costa et al.，2012）等水果發(fā)育成熟及顯色過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，鮮見有關(guān)桃果實(shí)ZDS基因（PpZDS）克隆及表達(dá)分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從黃肉品種桃果實(shí)中克隆PpZDS基因，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在桃果實(shí)不同成熟期的表達(dá)情況，為類胡蘿卜素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試黃肉桃果實(shí)品種金麗由浙江省奉化市水蜜桃研究所提供。分別在軟核期（盛花后35～45 d）、硬核期（盛花后55～65 d）、膨大期（盛花后95～105 d）、硬熟期（盛花后105～120 d）和完熟期（盛花后120～150 d）等不同桃果實(shí)成熟期進(jìn)行采摘備用。

植物RNA提取試劑盒購自美國Omega公司，第一鏈cDNA合成試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技（北京）有限公司，載體pMD18-T、宿主菌體大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、3'和5'末端序列擴(kuò)增試劑盒購自日本TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 總RNA提取 參照植物RNA提取試劑盒說明分別提取桃果實(shí)的果皮和果肉總RNA，加入適量無Rnase活性的DNaseⅠ酶液，去除殘留在總RNA中的微量DNA。

1. 2. 2 第一鏈cDNA合成 以提取的總RNA為模板，參照第一鏈cDNA合成試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1. 2. 3 基因克隆 通過NCBI搜索獲得草莓ZDS（FJ795343.1）、蘋果ZDS1（AF429983.1）和ZDS2（AF 429984.1）的氨基酸序列，利用Block Maker設(shè)計(jì)其中間保守區(qū)域的簡并引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段長度474 bp。反應(yīng)體系50.0 ?L：2×Es Taq Master Mix 25.0 ?L，10 ?mol/L上、下游引物（PpZDS-F/PpZDS-R）各2.0 ?L，1000 ng/?L cDNA模板1.0 ?L，Rnase-Free H2O補(bǔ)足至50.0 ?L。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行回收、純化。將目的片段連接至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，陽性菌液送至上海立菲生物技術(shù)公司測序。

利用Block Maker設(shè)計(jì)參考序列的3'和5'末端特異性RACE PCR擴(kuò)增引物（3'-PpZDS-F/3'-PpZDS-R，5'-PpZDS-F/5'-PpZDS-R）（表1），目的片段長度分別為872和959 bp。參照3'和5'末端序列擴(kuò)增試劑盒說明進(jìn)行RACE PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同樣經(jīng)上述的回收、純化、連接、轉(zhuǎn)化及測序。

1. 2. 4 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN 5.2.2將PCR擴(kuò)增獲得的中間片段與3'和5'末端序列進(jìn)行拼接，以獲得PpZDS基因全長。采用ExPASy查找其編碼區(qū)，并預(yù)測其編碼氨基酸序列和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；采用NCBI和GeneDoc 2.7.0進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列比對及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，以Predictprotein進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；以SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；并采用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 5 qRT-PCR檢測 根據(jù)拼接獲得的PpZDS基因序列，利用Primer 6.0設(shè)計(jì)其編碼區(qū)的qRT-PCR引物（表1）。參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測PpZDS基因在不同桃果實(shí)成熟期的表達(dá)情況。反應(yīng)體系25.0 ?L：cDNA模板1.0 ?L，100 ?mol/L上、下游引物各1.0 ?L，SYBR Green PCR混合液13.0 ?L，DEPC水補(bǔ)足至25.0 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s；72 ℃延伸15 s。共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以PpTEF2作為內(nèi)參基因，引物序列（PpTEF2-F/PpTEF2-R）見表1（Tong et al.，2009）。每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)3個(gè)重復(fù)，以去離子水為模板作為陰性對照。

1. 2. 6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，并采用Ori-ginPro 9.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PpZDS基因克隆

由圖1可知，PCR擴(kuò)增得到的中間片段、3'和5'末端序列長度與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示，3個(gè)目的片段長度分別為474、872和959 bp（圖1）。將其進(jìn)行序列拼接獲得PpZDS基因全長，長度為2014 bp。BLAST比對分析結(jié)果顯示，其與蘋果和草莓的ZDS基因具有較高同源性，表明成功克隆獲得PpZDS基因序列。

2. 2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 2. 1 理化性質(zhì) PpZDS基因具有完整的編碼區(qū)，編碼區(qū)長度為1716 bp，編碼571個(gè)氨基酸，其中酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）與堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）的數(shù)量分別為65和62，等電點(diǎn)（pI）為6.30，呈弱酸性。PpZDS基因編碼蛋白PpZDS分子式為C2825H4436N754O827S22，分子量為62.9 kD，脂溶指數(shù)為91.72，親水指數(shù)為-0.086，微溶于水。

2. 2. 2 氨基酸序列比對與功能結(jié)構(gòu)域分析 NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST比對分析結(jié)果（圖2）顯示，PpZDS蛋白與蘋果（Malus domestica，gi|33313474）、葡萄（Vitis vinifera，gi|399158070）、柚子（Citrus maxima，gi|190576747）、川桑（Morus notabilis，gi|587848957）、番木瓜（Carica papaya，gi|226295512）、煙草（Nicotia-na tabacum，gi|334199824）、向日葵（Helianthus annuus，gi|557798986）、胡蘿卜（Daucus carota，gi|7915 5662）和番茄（Solanum lycopersicum，gi|89279380）的ZDS蛋白同源性分別為94%、88%、87%、85%、85%、87%、84%、83%和83%，說明PpZDS蛋白與其他植物的ZDS蛋白同源性較高，克隆結(jié)果客觀可信，并將該序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號KJ789376）。

由圖2和圖3可知，第10～556位氨基酸為ZDS典型的功能域，第64～94位氨基酸為ZDS特征序列（KVAIIGAGLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR），屬于NAD_binding_8超級家族保守結(jié)構(gòu)域。

2. 2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析 由圖4可知，不同目種植物的ZDS蛋白分別聚類在不同分支，其中，PpZDS蛋白與同為薔薇目的蘋果（gi|33313474）和草莓（Fragaria×ananassa，gi|256041892）ZDS蛋白的親緣性較近，與菊目的向日葵（gi|557798986）、茄目的煙草（gi|334199824）、桔梗目的菊花（Chrysanthmun×morifolium gi|87299445）、管狀花目的番茄（gi|89279380）等植物ZDS蛋白的親緣性較遠(yuǎn)。可見，ZDS蛋白在不同目植物之間存在明顯分化，同目植物間分化程度較小。

2. 2. 4 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，PpZDS蛋白定位于葉綠體，可信度為82%。PpZDS蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件主要包括α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-折疊，其中α-螺旋占24.34%，無規(guī)則卷曲占64.80%；β-折疊占10.86%，與蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖5）基本吻合。

2. 3 PpZDS基因在桃果實(shí)不同成熟期的表達(dá)情況

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，反應(yīng)體系擴(kuò)增效率為94.1%，處于合理范圍（90.0%～110.0%），溶解曲線在80.4 ℃時(shí)出現(xiàn)溶解單峰，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，表明設(shè)計(jì)的qRT-PCR引物可用于檢測桃果實(shí)不同成熟期PpZDS基因的表達(dá)情況。

由圖6可知，整個(gè)桃果實(shí)成熟期PpZDS基因在果肉和果皮中均有表達(dá)，從軟核期至硬熟期呈逐漸升高趨勢，硬熟期達(dá)最高，完熟期降低，表明PpZDS基因的表達(dá)可能誘導(dǎo)桃果實(shí)成熟；不同桃果實(shí)成熟期果肉中的PpZDS基因表達(dá)量均高于果皮中表達(dá)量，其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果實(shí)中PpZDS基因在果肉中的表達(dá)量顯著高于果皮中的表達(dá)量（P<0.05），其原因可能是桃果肉中的類胡蘿卜素合成量高于果皮。可見，PpZDS基因過表達(dá)對桃果實(shí)類胡蘿卜素的積累及呈色發(fā)揮正向調(diào)控作用。

3 討論

ZDS作為類胡蘿卜素生物合成途徑中的重要限速酶，廣泛存在于植物中（高慧君等，2015）。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物ZDS蛋白均含有NAD_binding_8超級家族保守結(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域中存在ZDS特征序列，推測ZDS以NAD（H）作為輔助因子或電子受體發(fā)揮獨(dú)特的催化作用（王柬人等，2012；鐘淮欽等，2015）。本研究根據(jù)同源蛋白基因序列設(shè)計(jì)PpZDS基因擴(kuò)增引物，成功克隆獲得PpZDS基因全長序列，長度為2014 bp，具有完整的編碼區(qū)（長度為1716 bp），編碼571個(gè)氨基酸，與同為薔薇目的蘋果ZDS蛋白氨基酸序列同源性達(dá)94%，第10～556位氨基酸為ZDS典型的功能域，第67～133位氨基酸為ZDS特征序列，屬于NAD_binding_8超級家族保守結(jié)構(gòu)域，與上述前人研究結(jié)果基本一致，已將該序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫（GenBank登錄號KJ789376）。

近年來，大量研究表明，ZDS基因的表達(dá)與果實(shí)類胡蘿卜素的積累及呈色密切相關(guān)。Rodrigo等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，ZDS基因的表達(dá)對柑橘果實(shí)呈色及色素積累發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用。高新征等（2009）、Chan-Leon等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，ZDS基因在番木瓜的葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，但在成熟果實(shí)中的表達(dá)量明顯高于葉和花中的表達(dá)量。李永平等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，ZDS基因在草莓的花和果實(shí)中均有表達(dá)，表明ZDS基因?qū)麑?shí)中類胡蘿卜素的積累及花和果實(shí)呈色具有重要的調(diào)控作用。Wisutiamonkul等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，ZDS基因的表達(dá)與榴蓮果實(shí)中總類胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和葉黃素的含量呈顯著正向相關(guān)，推測ZDS基因是榴蓮果實(shí)發(fā)育過程中類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，整個(gè)桃果實(shí)成熟期PpZDS基因在果皮和果肉中均有表達(dá)，且從軟核期至硬熟期均呈逐漸升高趨勢，硬熟期達(dá)最高，完熟期降低，但在果肉中表達(dá)量均高于果皮，表明PpZDS基因的表達(dá)與果實(shí)的成熟程度呈正相關(guān)，推測PpZDS基因在果實(shí)中類胡蘿卜素的積累及呈色中發(fā)揮調(diào)控作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

PpZDS基因表達(dá)對桃果實(shí)果肉類胡蘿卜素生物合成及果皮呈色發(fā)揮正向調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）