廣西野生黃花蒿根際土壤AM真菌類型調(diào)查分析

馬俊卿 韋竹立 覃京龍 李志平 黃海瑞 仇惠君 黃榮韶 曾燕紅 張金蓮 陳廷速 曾富蘭 黃京華

摘要：【目的】調(diào)查廣西野生黃花蒿根際土壤叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，AM）真菌與野生黃花蒿的共生情況及其根際土壤理化性狀差異，為篩選對廣西野生黃花蒿生長有明顯促進作用的高效菌株及推動AM真菌在黃花蒿生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎杉吧S花蒿根際2～30 cm土樣，分別測定土壤pH、有機質(zhì)碳、速效磷、堿解氮和速效鉀含量，采用濕篩傾析—蔗糖離心法分離AM真菌孢子，觀察記錄孢子數(shù)量、形態(tài)并進行AM真菌類型劃分和鑒定?！窘Y(jié)果】不同采樣點的野生黃花蒿均被AM真菌侵染，對野生黃花蒿的侵染率在29.15%～40.43%，其中崇左市土樣的侵染率最高，南寧馬山縣土樣的侵染率最低；10 g風干土樣中的孢子數(shù)量以崇左市的最高（163個），百色田林縣的最低（32個）；不同樣點的侵染強度為2～3級，屬中等偏下水平。不同樣點的土壤pH在7.61～8.38，屬弱堿性土壤；土壤有機質(zhì)碳含量為5.15～58.08 g/kg，速效磷、堿解氮和速效鉀含量分別為54.71～551.20、98.70～595.00和66.89～547.30 mg/kg，不同樣點間差異明顯。AM真菌孢子密度、種類豐度（SR）和物種多樣性指數(shù)也因采樣點不同而存在明顯差異。從9個地區(qū)55份土樣中共分離出42種不同種類的AM真菌?！窘Y(jié)論】廣西野生黃花蒿根際AM真菌的分布因地理位置不同而存在差異，與土壤營養(yǎng)狀況基本呈反比。野生黃花蒿根際土壤環(huán)境差異可能是造成AM真菌多樣性的重要原因。

關(guān)鍵詞： 野生黃花蒿；叢枝菌根（AM）真菌；多樣性；廣西

中圖分類號： S567.219 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）05-0870-07

Abstract：【Objective】Symbiosis of arbuscular mycorrhizal（AM） fungi in the rhizosphere soil of Artemisia annua L. in Guangxi and wild A. annua and the physical and chemical character differences in rhizosphere soil were investigated to provide reference for the exploration of effective strains which could promote the growth of wild A. annua in Guangxi and the application of AM fungi in A. annua production. 【Method】Soil samples of 2-30 cm in rhizosphere of wild A. annua were collected to determine soil pH， organic carbon， available phosphorus， alkali-hydrolyzale nitrogen and available potassium. The spores of AM fungi were separated by wet sieve decantation-sucrose centrifugation method. The number and morphology of spores were observed and recorded， and types of AM fungi were divided and indentified. 【Result】All wild A. annuas in different sampling sites were infected by AM fungi. The infection rate of AM fungi on wild A. annua was 29.15%-40.43%， with the infection rate of soil samples in Chongzuo being the highest and that of Mashan， Nanning the lowest. Chongzuo held the largest number of spores（163 spores） in each 10 g air drying soil sample， while Tianlin， Baise held the smallest number（32 spores）. The infection intensity in different locations was 2-3 grade， which was at medium and low level. The soil pH in different locations was 7.61-8.38， which belonged to weakly alkaline soil. The organic carbon content of soil was 5.15-58.08 g/kg. Contents of available phosphorus， alkali-hydrolyzale nitrogen and available potassium were 54.71-551.20，98.70-595.00 and 66.89-547.30 mg/kg respectively and showed marked difference among different locations. The spore density of AM fungi，species abundance（SR） and species diversity index greatly varied from different locations as well. Fourty-two different species of AM fungi were separated from fifty-four soil samples in nine regions. 【Conclusion】The distribution of AM fungi in wild A. annua rhizosphere soil varies from different geographical locations， and it is inversely proportional to the soil nutrition. The environmental differences in rhizosphere soil of wild A. annua could be significant cause to the diversity of AM fungi.

Key words： wild Artemisia annua L.； arbuscular mycorrhizae（AM） fungi； diversity； Guangxi

0 引言

【研究意義】黃花蒿（Artemisia annua L.）為菊科艾屬植物，其干燥地上部分稱為青蒿，具有抗炎、抗腫瘤等作用（仇惠君，2013），從黃花蒿中提取的青蒿素被世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦為當前世界治療瘧疾的首選藥。叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，AM）真菌簡稱AM真菌，可與地球上大多數(shù)被子植物共生形成叢枝菌根。叢枝菌根是自然界普遍存在的一種共生現(xiàn)象，能夠擴大根系吸收范圍，促進作物對養(yǎng)分的吸收（黃京華等，2003）。AM真菌形成菌根后會減少植物根系與化感物質(zhì)的直接接觸，改善作物的生理特性進而提高作物抗性（李興發(fā)，2015）。廣西是我國黃花蒿的主產(chǎn)地，20世紀80年代廣西黃花蒿的分布面積較大，在8個地區(qū)40余縣均有分布，年產(chǎn)量在4000 t以上（韋記青等，2005），截至2005年廣西種植青蒿約670 ha（唐其展等，2006）。然而黃花蒿連作會顯著抑制其生長，降低葉片生物量、青蒿素含量及產(chǎn)量，還會不同程度地降低土壤有機質(zhì)碳、有效氮和有效磷含量（李倩等，2016）。黃花蒿的青蒿素含量受產(chǎn)地、品種、生長階段及光照強度、土壤等環(huán)境因素的影響，AM菌根會促進黃花蒿對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，增強葉片光合作用，調(diào)節(jié)黃花蒿體內(nèi)倍半萜環(huán)化酶、內(nèi)脂形成過程中氧化酶和加氧酶的活性，從而促進青蒿素的積累（黃京華等，2011）。因此，調(diào)查并分析廣西野生黃花蒿叢枝菌根情況，對今后篩選與黃花蒿共生的優(yōu)勢菌株及促進廣西黃花蒿生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進展】目前，全世界被發(fā)現(xiàn)和描述的AM真菌大約有260種，我國發(fā)現(xiàn)并描述的約有130種。根據(jù)孢子形態(tài)特征及真菌結(jié)構(gòu)鑒定的AM真菌種類有150～200個（蓋京蘋等，2005）。土壤是孢子的天然培養(yǎng)基，不同基質(zhì)pH和養(yǎng)分有效性等不同，對AM真菌發(fā)育和功能的影響也不同（石兆勇等，2002），許多研究者已對AM真菌與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系進行探索。陳寧等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中的通氣和水分狀況不同程度地影響著菌根真菌的生長發(fā)育。郭濤等（2009）研究表明，AM真菌種的豐度與土壤有機質(zhì)碳、速效磷含量呈顯著負相關(guān)，并認為真菌、環(huán)境、寄主植物三者間構(gòu)成動態(tài)平衡，各生態(tài)因子相互制約、相互聯(lián)系。寧佳緒（2009）研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌的多樣性隨土壤水含量、pH和電導率的增大而相應(yīng)增大。吳麗莎等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，寄主植物和根際環(huán)境狀況在一定條件下影響AM真菌的群落結(jié)構(gòu)。孫向偉等（2011）研究表明，土壤的類型、pH、濕度、通透性和營養(yǎng)元素含量及土壤微生物等理化性狀均會影響AM真菌孢子的群落動態(tài)。不同的AM真菌對生境的選擇和適應(yīng)不同，生態(tài)因素會影響AM真菌的多樣性和分布規(guī)律（廖楠等，2016），土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)與年均溫度和年均降水顯著相關(guān)（李雪靜等，2017）。此外，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不同管理措施也會不同程度地干擾AM真菌優(yōu)勢功能的發(fā)揮（裘浪等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】廣西AM真菌資源豐富（王幼珊等，2016），但關(guān)于廣西野生黃花蒿根際土壤AM真菌情況的調(diào)查研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從廣西野生黃花蒿分布區(qū)采集黃花蒿根際土壤樣品進行檢測，研究AM真菌與野生黃花蒿的共生情況及其根際土壤理化性狀差異，并從土樣中分離鑒定出與黃花蒿共生的AM真菌，以期為今后篩選對廣西野生黃花蒿生長有明顯促進作用的高效菌株及推動AM真菌在黃花蒿生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試土壤采集于廣西百色市、百色田林縣、百色平果縣、南寧武鳴縣、崇左市、南寧天雹水庫及金沙湖、南寧馬山縣、柳州融安縣等有野生黃花蒿生長的地方，土壤樣本共計55份（表1）。

1. 2 試驗方法

2012年8月在試驗區(qū)有野生黃花蒿生長的地方進行采樣并記錄采樣點概況，先去掉表土2 cm，取植株周圍2～30 cm深度的根系土壤，用四分法淘汰多次，直至剩余1 kg為止，把獲取的混合土樣裝入自封袋，附上標簽，記錄采樣人、采樣時間、地點等相關(guān)事項；每個采集點黃花蒿根系帶回實驗室用50%乙醇固定，供測定AM真菌對野生黃花蒿的侵染率；將泥土放在室內(nèi)常溫下自然風干后測定其理化性質(zhì)和AM真菌孢子密度，剩余土樣進行擴繁、純化、分離和鑒定等AM真菌多樣性研究。

于2015年9月～2016年1月在廣西大學科研溫室采用分層撒播法對采集土樣（每份約200 g）進行擴繁，擴繁寄主為玉米品種正大619。

1. 3 測定項目及方法

1. 3. 1 土壤理化性狀測定 參照《土壤農(nóng)化分析》（鮑士旦，2000）的方法，pH采用電位法測定，有機質(zhì)碳含量采用重鉻酸鉀容量—外加熱法測定，速效磷含量采用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法測定，堿解氮含量采用堿解擴散法測定，速效鉀含量采用火焰光度法測定。

1. 3. 2 AM真菌侵染率測定 將野生黃花蒿根系取回實驗室后室溫保存于50%乙醇中，按透明—脫色—酸化—染色—褪色的步驟進行處理（廖楠，2016），參考《叢枝菌根及其應(yīng)用》（劉潤進和李曉林，2000）中的方法進行侵染率測定。按照AM真菌對植物根系的侵染率劃分侵染強度，侵染率在0～20%為1級，20%～40%為2級，40%～60%為3級，60%～80%為4級，80%～100%為5級（盛萍萍等，2011）。

1. 3. 3 AM真菌孢子數(shù)觀測 采用濕篩傾析—蔗糖離心法篩選出AM真菌孢子混合物（汪茜等，2016），置于培養(yǎng)皿濾紙上，解剖鏡下觀測記錄孢子數(shù)量（個/10 g風干土，1個孢子果按1個孢子計數(shù)），并觀察孢子形態(tài)。根據(jù)以上觀察結(jié)果，按照《叢枝菌根及其應(yīng)用》（劉潤進和李曉林，2000）、《VA菌根真菌鑒定手冊》（Schenck and Perez，1988）及INVAM國際網(wǎng)站（http：//invam.caf.wvu.edu）提供的叢枝菌根真菌種類的描述和圖片，同時參閱吳麗莎等（2009）、楊春雪和李麗麗（2014）發(fā)表的新種、新紀錄種進行AM真菌類型劃分和鑒定。

1. 4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

AM真菌種類豐度（SR）指根際10 g土壤中含有的AM真菌不同種類數(shù)。SR=AM真菌總種類次數(shù)/土壤樣本數(shù)。

孢子密度指單位質(zhì)量土樣中AM真菌所有種孢子數(shù)與土壤樣本數(shù)的比值。

多樣性采用Shannon-Wiener指數(shù)（H'）和Simpson指數(shù)（D）來測度，假設(shè)有一個包含N個個體的隨機樣本，其中i的個體數(shù)為Ni，則Pi=Ni/N，即：

H'=-[i=1s（PilnPi）]

D=1-[i=1s（Pi×Pi）]

式中，S為某樣地中AM真菌的種數(shù)，Pi為某AM真菌的孢子占該樣地所有孢子的百分比。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，采用Excel 2007繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2. 1 廣西野生黃花蒿AM真菌孢子數(shù)、侵染率及根際土壤理化性質(zhì)

由表2可知，9個采樣點的野生黃花蒿均被AM真菌侵染，證明廣西野生黃花蒿為菌根型植物。不同樣點AM真菌對野生黃花蒿的侵染率在29.15%～40.43%，其中崇左市土樣的侵染率最高，南寧馬山縣土樣的侵染率最低。崇左市10 g風干土樣中的孢子數(shù)量最高，達163個；百色田林縣的最低，僅為32個。不同樣點的侵染強度為2～3級，說明所調(diào)查地區(qū)的野生黃花蒿對AM真菌的依賴性屬于中等偏下水平。

由表2還可看出，各采樣點的土壤理化性質(zhì)存在明顯差異。不同樣點的土壤pH在7.61～8.38，均屬弱堿性土壤。土壤有機質(zhì)碳、速效磷、堿解氮和速效鉀含量在不同樣點間差異明顯，其中，百色田林縣土樣的有機質(zhì)碳含量最高（58.08 g/kg），南寧武鳴縣土樣的有機質(zhì)碳含量最低（5.15 g/kg）；南寧天雹水庫土樣的速效磷含量最高（551.20 mg/kg），崇左市土樣的速效磷含量最低（54.71 mg/kg）；南寧馬山縣土樣的堿解氮含量最高（595.00 mg/kg），南寧武鳴縣土樣的堿解氮含量最低（98.70 mg/kg）；百色田林縣土樣的速效鉀含量最高（547.30 mg/kg），百色平果縣土樣的速效鉀含量最低（66.89 mg/kg）。不同地區(qū)土樣營養(yǎng)元素含量的差異可能與其土壤類型、耕作方式及施肥水平不同等因素有關(guān)。

2. 2 廣西野生黃花蒿根際土壤AM真菌的孢子密度、種類豐度和物種多樣性指數(shù)

由表3可看出，廣西野生黃花蒿根際土壤AM真菌的孢子密度、SR、H'和D因取樣地區(qū)不同而存在明顯差異。崇左市土樣的AM真菌孢子密度最大，為23.29，南寧馬山縣土樣的AM真菌孢子密度次之，為22.00；南寧天雹水庫和南寧市金沙湖土樣的AM真菌孢子密度較小，分別為6.89和9.89。崇左市土樣的AM真菌SR最高，為4.71，百色田林縣土樣的AM真菌SR最低，為1.00；AM真菌的H'以崇左市土樣最高（2.38）、百色田林縣土樣最低（0.99）；AM真菌的D以崇左市和南寧金沙湖土樣最高，二者均為0.90，百色田林縣土樣最低（0.57）。圖1～圖4的雷達圖更直觀展示了各采樣地根際土壤AM真菌的種類豐度、孢子密度及物種多樣性情況。

2. 3 不同采樣點野生黃花蒿根際土壤AM真菌優(yōu)勢種

經(jīng)過擴繁、分離及純化，從9個采樣點的樣品中共分離出42個不同種類的AM真菌，每個樣點的優(yōu)勢種類如圖5所示。從圖5可看出，百色市土樣的AM真菌優(yōu)勢種經(jīng)Melzer染色后呈褐色，具雙層膜，壓破后呈馬蹄狀（圖5-A）；百色田林縣土樣的AM真菌優(yōu)勢種經(jīng)Melzer染色后呈土黃色，具雙層膜且最外層膜易脫落（圖5-B）；百色平果縣土樣的AM真菌優(yōu)勢種具有較長的孢子柄和雙層膜，且兩層膜結(jié)合緊密不易脫落（圖5-C）；南寧武鳴縣土樣的AM真菌優(yōu)勢種經(jīng)Melzer染色后呈灰褐色，雙層膜，膜表面粗糙（圖5-D）；崇左市土樣的AM真菌優(yōu)勢種經(jīng)Melzer染色后呈黃色，3層膜，最外層膜易脫落且經(jīng)壓片后表面有褶皺，有孢子柄（圖5-E）；南寧天雹水庫土樣的AM真菌優(yōu)勢種具雙層膜，內(nèi)層膜經(jīng)Melzer染色后呈黃色，外層膜經(jīng)Melzer染色后呈紫粉色且易脫落（圖5-F）；南寧金沙湖土樣的AM真菌優(yōu)勢種經(jīng)Melzer染色后呈褐色且表面有絮狀物覆蓋，兩層膜結(jié)合緊密（圖5-G）；南寧馬山縣土樣的AM真菌優(yōu)勢種經(jīng)Melzer染色后呈黃水晶色，單層膜，內(nèi)含物豐富（圖5-H）；柳州融安縣土樣的AM真菌優(yōu)勢種經(jīng)Melzer染色后呈淡黃色，雙層膜，最外層膜易脫落且壓片后表面有褶皺（圖5-I）。

3 討論

本研究從廣西野生黃花蒿分布區(qū)采集黃花蒿根際土壤樣品進行檢測，從9個地區(qū)55份土樣中共分離出42種不同種類的AM真菌，表明廣西野生黃花蒿根際土壤AM真菌多樣性較豐富；同時對不同地區(qū)土樣的理化性質(zhì)進行測定，發(fā)現(xiàn)各地土樣的pH、有機質(zhì)碳、堿解氮、速效鉀和速效磷差異明顯，且在不同程度上影響著AM真菌的侵染率及多樣性，表明AM真菌對植物的侵染力與土壤生態(tài)環(huán)境及理化性質(zhì)關(guān)系密切，與王宇濤等（2013）的研究結(jié)果一致。

野生黃花蒿根際土壤中AM真菌對弱堿性土壤的pH變化較敏感，土壤pH對AM真菌有一定的影響（張美慶等，1999）；土壤中堿解氮含量的變化與AM真菌的孢子密度及其對黃花蒿侵染率的影響不明顯，但AM真菌對野生黃花蒿侵染率的最大值出現(xiàn)在低氮水平，可推斷土壤中堿解氮含量的變化不是影響黃花蒿菌根侵染率的主要因素，但低氮水平有利于AM真菌對野生黃花蒿的侵染，這種現(xiàn)象可能源于氮、磷之間的交互作用（郭濤等，2009）。土壤速效鉀與野生黃花蒿根際AM真菌的孢子數(shù)整體上呈反比，但與AM真菌對黃花蒿的侵染率整體上呈正比，即高鉀水平有利于AM真菌侵染但會導致AM真菌孢子數(shù)量減少，可能是土壤中的鉀會提高優(yōu)勢菌種的競爭力，但具體原因仍需進一步驗證。土壤中的速效磷含量和AM真菌相關(guān)活力呈線性關(guān)系，隨著磷水平的升高，AM真菌的各項指標下降，且高磷水平明顯抑制了AM真菌對野生黃花蒿的侵染率及孢子數(shù)，與黃京華等（2006）得出的土壤中速效磷含量與AM真菌相關(guān)活力呈反比的結(jié)論相同。隨著土壤有機質(zhì)碳含量的增加，AM真菌的相關(guān)指標呈下降趨勢，可推測AM真菌孢子數(shù)及其對野生黃花蒿的侵染率可能與根際土壤有機質(zhì)碳含量存在負相關(guān)性，與蓋京蘋和劉潤進（2003）的研究結(jié)果相似。本研究所選樣點中，南寧天雹水庫和南寧金沙湖土樣中AM真菌孢子密度最低，這兩個地區(qū)均靠近水源，土壤水含量高于其他地區(qū)，說明土壤水含量高會導致野生黃花蒿根際AM真菌密度降低，可能是土壤水含量高時植物可利用的水分較充足，對AM真菌的依賴相對較小。

本研究選取不同樣點調(diào)查分析廣西野生黃花蒿根際土壤AM真菌的種類、孢子密度、侵染率及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，但未對AM真菌進行細致準確的種屬鑒定，也尚未通過田間試驗篩選出高效菌株，后期試驗將通過PCR-DGGE分析（蓋京蘋等，2005）及SSU rRNA基因序列系統(tǒng)分析（王幼珊等，2016）進一步驗證，對廣西野生黃花蒿AM真菌的多樣性進行更深入、更精確、更科學地分析，以期篩選出能夠促進野生黃花蒿生長和品質(zhì)提升的高效菌種，進而有針對性地研發(fā)出專用菌劑。

4 結(jié)論

廣西野生黃花蒿根際土壤AM真菌的分布因地理位置不同而存在差異，營養(yǎng)元素含量偏高的土樣中AM真菌孢子密度偏低，推測野生黃花蒿根際土壤AM真菌的相關(guān)活力與土壤營養(yǎng)狀況基本呈反比。野生黃花蒿根際土壤環(huán)境差異可能是造成AM真菌多樣性的重要原因。

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（責任編輯 王 暉）