擬環(huán)紋豹蛛熱休克蛋白20基因的克隆與分析

李長春 王永 姚國新 戴余軍 李國元

摘要：【目的】克隆擬環(huán)紋豹蛛熱休克蛋白20基因（HSP20），并分析其在鎘脅迫下的表達(dá)情況，為揭示蜘蛛抵御重金屬脅迫機(jī)制提供參考?！痉椒ā恳詳M環(huán)紋豹蛛雌蛛為試驗(yàn)材料，在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，通過RT-PCR克隆擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因（PpHSP20），用生物信息學(xué)方法對其序列特征進(jìn)行分析，并采用熒光定量PCR檢測鎘脅迫下PpHSP20基因的相對表達(dá)量?！窘Y(jié)果】克隆獲得的PpHSP20基因編碼區(qū)長525 bp，編碼174個氨基酸，其編碼蛋白分子量20.08 kD，等電點(diǎn)5.97，具有小分子熱休克蛋白家族典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域，與溫室擬肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum）α-晶體蛋白A有較高的相似性（58%）。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，鎘脅迫下PpHSP20基因的表達(dá)量顯著增加（P<0.05）?！窘Y(jié)論】擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因在抵御鎘脅迫中發(fā)揮調(diào)控作用，可作為研究蜘蛛抵御鎘脅迫的重要候選基因和潛在的生物標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞： 擬環(huán)紋豹蛛；HSP20基因；基因克?。粺晒舛縋CR

中圖分類號： S186；Q956 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）08-1525-06

0 引言

【研究意義】小分子熱休克蛋白（Small heat shock protein， sHSP）是自然界中含量最豐富的一類分子伴侶，在動植物和微生物中廣泛存在，除參與細(xì)胞正常生理活動外，在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下高效表達(dá)，對抵御環(huán)境脅迫具有重要作用（Hilton et al.， 2013； King and Macrae， 2015）。環(huán)境重金屬污染是一種普遍現(xiàn)象，在我國以農(nóng)田鎘污染尤為突出，部分污染區(qū)土壤鎘含量遠(yuǎn)高于現(xiàn)行《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618—1995）規(guī)定的限量值，對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成了嚴(yán)重威脅（Wei and Yang， 2010； He et al.， 2013）。蜘蛛普遍存在于各種生境中，其種類多、數(shù)量大、繁殖快（申效誠等，2013）。近年來，人們發(fā)現(xiàn)活躍的游獵型蜘蛛可積累并耐受高濃度的鎘，是環(huán)境毒理學(xué)研究的理想材料（Shao et al.， 2006； Yang et al.， 2016）。擬環(huán)紋豹蛛（Pardosa pseudoannulata）在我國農(nóng)田廣泛分布，是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲天敵（Lou et al.， 2013）。因此，研究擬環(huán)紋豹蛛小分子熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，對明確蜘蛛抵御重金屬等環(huán)境脅迫的機(jī)制，以及利用蜘蛛作為重金屬污染指示生物等均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】熱休克蛋白（Heat shock protein， HSP）是生物體受到刺激后大量合成、結(jié)構(gòu)高度保守的應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞抵御環(huán)境脅迫及維持正常功能過程中發(fā)揮重要作用（黃建芳等， 2015）。根據(jù)分子量大小、結(jié)構(gòu)和功能，HSP通常被分為6個家族，即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSP（Snoeckx et al.，2001）。其中，sHSP的分子量一般在12～43 kD，結(jié)構(gòu)上沒有其他家族保守，但具有共同的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域（α-crystallin， ACD）（Van et al.， 2001）。近年來，已在果蠅（Drosophila melanogaster）、家蠶（Bombyx mori）、中華稻蝗（Oxya chinensis）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）等昆蟲中開展了sHSP結(jié)構(gòu)和功能的研究（寇利花等， 2015）。Morrow等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，果蠅線粒體HSP22蛋白能保護(hù)其線粒體中其他蛋白和影響其衰老進(jìn)程，HSP22的過量表達(dá)能顯著增強(qiáng)其抵御氧化損傷的能力。Liu等（2013）從柞蠶（Anthe-raea pernyi）體內(nèi)克隆獲得一個編碼186個氨基酸的HSP21，并通過RT-qPCR和Western印跡法證明其在柞蠶熱耐受過程中發(fā)揮重要作用。You等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）sHSP24.1基因的表達(dá)量隨鎘濃度的增加和脅迫時間的延長先升高后降低，推測sHSPs在鎘初始脅迫時發(fā)揮了保護(hù)作用，應(yīng)激后則蟲體內(nèi)其他解毒系統(tǒng)開始發(fā)揮作用。寇利花等（2015）用不同濃度Cd2+對中華稻蝗5齡若蟲染毒處理后，利用RT-qPCR進(jìn)行定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其精巢和卵巢中5個sHSP基因在鎘急性誘導(dǎo)下以不同的模式表達(dá)，表達(dá)量與鎘的濃度和作用時間有關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)重金屬鎘可在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)大量富集，并對其生長繁殖和生理代謝產(chǎn)生顯著影響（Li et al.， 2016a），但對蜘蛛抵御重金屬脅迫的具體機(jī)制了解不多，有關(guān)擬環(huán)紋豹蛛sHSP基因序列分析和鎘脅迫下差異表達(dá)的研究尚無報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在借助高通量測序技術(shù)獲得的擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上（Li et al.， 2016b），篩選出HSP20基因拼接序列，采用RT-PCR獲得其全長cDNA序列，用在線生物信息學(xué)方法對其序列特征進(jìn)行分析，并采用熒光定量PCR檢測0.2和2.0 mmol/L CdCl2脅迫下HSP20基因的相對表達(dá)量，為深入揭示蜘蛛抵御重金屬脅迫機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

擬環(huán)紋豹蛛亞成蛛采自武漢馬鞍山森林公園（東經(jīng)114°31′，北緯30°52′），單頭置于試管后放入人工氣候箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（26±1）°C、相對濕度70%、光照周期14 L∶10 D。參考前期研究，在雌蛛成熟2 d后，用0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液進(jìn)行飲用水染毒處理，以ddH2O為對照。每處理3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)不少于6頭蜘蛛（Li et al.，2016a， 2016b）。處理7 d后液氮速凍保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒、PrimerScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser基因組DNA去除及反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPs Mixture、Ex Taq酶和DL2000 DNA Marker購自大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；EasyPure? Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、pEASY?-T1 Cloning Kit克隆載體、Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Gray-96G基因擴(kuò)增儀購自上海山富科學(xué)儀器有限公司；Bio-Best 200M凝膠成像系統(tǒng)購自美國西蒙公司；ViiaTM 7實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 RNA提取及cDNA合成 參照SanPrep柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒說明提取擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 2. 2 HSP20基因擴(kuò)增 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因（PpHSP20）序列用Primer 5.0設(shè)計引物[HSP20-F（5'-GCGACTCGGGTTGAAAAAGCTG-3'）和HSP20-R（5'-TTCACTGGTCGTCCC

CTTTTAATG-3'）]，以擬環(huán)紋豹蛛cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20.0 μL，其中cDNA模板1.0 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，MgC12（25 mmol/L）1.6 μL，dNTPs Mixture（10 μmol/L）1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1. 2. 3 基因克隆與測序 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，EasyPure? Quick Gel Extraction Kit回收后連接克隆載體pEASY?-T1 Cloning Kit，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選陽性克隆。陽性克隆送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

1. 2. 4 生物信息學(xué)分析 用NCBI BLAST工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行BlastP分析，采用在線軟件NCBI ORF Finder分析克隆基因的開放閱讀框（ORF），用ProtParam（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam）分析編碼蛋白質(zhì)的分子式、分子量和等電點(diǎn)等，用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale）分析該蛋白序列的疏水性，用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測蛋白序列的三級結(jié)構(gòu)，采用MEGA 5.2中的Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Bootstrap值設(shè)為1000。

1. 2. 5 Cd脅迫下PpHSP20基因表達(dá)分析 以0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液作飲用水處理擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛7 d后，合成處理組和對照組蜘蛛的cDNA作熒光定量PCR檢測模板。用Primer 5.0設(shè)計定量分析引物，[PpHSP20-F（5'-CCGGAAGAACTGCAGGTGAAGGT-3'）和PpHSP20-R（5'-CGTCGTTTCGTTCCTCGTGCTT-3'）]，參照SYBR Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus， ROX plus）說明進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系20.0 μL，其中SYBR Premix Ex Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán)；60～95 ℃用于標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。所有樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，內(nèi)參引物為：β-actin-F（5'-TGTCGCCTTGGACTTTGAGC-3'）和β-actin-R（5'-CATTGCCGATGGTGATAACT-3'）。反應(yīng)結(jié)束后，用2-ΔΔCt法計算處理組和對照組各基因的表達(dá)水平。不同濃度鎘脅迫下PpHSP20基因表達(dá)量差異用Students-t檢驗(yàn)，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PpHSP20基因擴(kuò)增結(jié)果

在前期對擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組測序和組裝的基礎(chǔ)上，挑選一條被注釋為HSP20/α-晶體蛋白家族的unigene（c98797.graph_c0）。根據(jù)該序列設(shè)計的特異性引物，以擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測圖譜（圖1）顯示，約在700 bp處擴(kuò)增出清晰、明亮的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物后克隆到pEASY?-T1 Cloning Kit克隆載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞。將菌落PCR篩選的陽性克隆送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序，所得序列長度為716 bp，經(jīng)Genetool比對顯示堿基序列與轉(zhuǎn)錄組測得堿基序列一致，命名為PpHSP20。

2. 2 PpHSP20基因及其推導(dǎo)氨基酸的序列分析結(jié)果

將獲得的序列在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行在線分析，結(jié)果（圖2）表明，所克隆的PpHSP20基因包含一個525 bp的完整ORF，編碼174個氨基酸。利用NCBI BLASTp檢索PpHSP20基因編碼蛋白的氨基酸序列，分析結(jié)果表明，擬環(huán)紋豹蛛HSP20與溫室擬肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum） α-晶體蛋白A（XP_015904099.1）和桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）HSP21.6（ARQ14800.1）具有較高的相似性，分別為58%和51%。

2. 3 PpHSP20基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用NCBI Conserved Domains在線軟件分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)PpHSP20蛋白具有典型的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域，由約80個氨基酸組成，含有12個預(yù)測的二聚體形成接觸位點(diǎn)，且同源區(qū)域?qū)儆贖sps-p23樣超家族。利用GenBank的ProtParam在線軟件預(yù)測擬環(huán)紋豹蛛HSP20的分子式為C885H1366N252O270S7，分子量為20.08 kD，等電點(diǎn)為5.97，包含20種氨基酸，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)分別為58.61，為不穩(wěn)定蛋白。

PredictProtein預(yù)測擬蛋白的二級結(jié)構(gòu)，其中PpHSP20蛋白無規(guī)則卷曲占比為58.62%，延伸鏈占比為27.01%，α-螺旋占比為14.37%。SWISS-MODEL預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)表明，PpHSP20編碼的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中蛋白4ydz.1.B匹配相似度為39.22%，匹配氨基酸數(shù)目為65～165個，GMQE值為0.41，QMEAN值為-1.34。ProtScale預(yù)測發(fā)現(xiàn)擬環(huán)紋豹蛛PpHSP20蛋白第105位氨基酸親水性最強(qiáng)，平均分值為-0.679，表明為親水性蛋白（圖4）。

將PpHSP20蛋白序列與家蠶（Bombyx mori） HSP20.4（NP_001037038.1）、黑脈金斑蝶（Danaus plexippus）HSP19.8（OWR44131.1）、蘋果蠹蛾（Cy-dia pomonella）HSP19.8（ADX96000.1）、梨小食心蟲（Grapholita molesta）HSP21.4（AKS40075.1）、美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）HSP21.7（ABE57139.1）、南美斑潛蠅（Liriomyza huidobrensis）HSP20（ABE57137.1）、長尾水青蛾（Actias selene）HSP20.8（ALI87024.1）和溫室擬肥腹蛛 HSP beta-1-like（XP_015921832.1）等節(jié)肢動物的sHSP氨基酸序列進(jìn)行多重比較，利用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)擬環(huán)紋豹蛛HSP20與溫室擬肥腹蛛HSP beta-1-like聚為一小支，并與鱗翅目的黑脈金斑蝶和蘋果蠹蛾兩個HSP19.8聚為一類，而雙翅目的2種斑潛蠅聚為一小支后，與其他幾種鱗翅目的昆蟲聚為一類。

[ L.sativae Hsp21.7 ][ L.huidobrensis Hsp20 ][ A.selene HSP20.8 ][ B.mori HSP20.4][ G.molesta HSP21.4][ P.pseudoannulata HSP20][ P.tepidariorum HSP beta-1-like ][ D.plexippus HSP19.8][ C.pomonella HSP19.8 ][100][100][70][58][48][47][0.2]

2. 4 鎘脅迫下PpHSP20基因的表達(dá)分析結(jié)果

通過熒光定量PCR分析雌成蛛PpHSP20基因在0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液作飲用水處理7 d的表達(dá)情況，結(jié)果（圖6）顯示，在0.2和2.0 mmol/L CdCl2脅迫下PpHSP20基因的相對表達(dá)量明顯提高，分別是對照組的4.5和7.9倍。2.0 mmol/L CdCl2處理下PpHSP20基因相對表達(dá)量顯著高于0.2 mmol/L CdCl2處理組（P<0.05），表明鎘脅迫誘導(dǎo)了擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)HSP20基因的表達(dá)。

3 討論

sHSP家族保守性不如Hsp70和Hsp90等其他熱休克蛋白家族，其至少包括9個亞類，且所有sHSP的C端均含有一個80～100個氨基酸的α-晶狀體蛋白保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常含有7～8個反相平行的β-折疊片，在分子識別和分子伴侶功能上發(fā)揮重要作用，是鑒定sHSP家族成員的重要特征，在分子進(jìn)化分析上也具有重要意義（Van et al.， 2001； Sun and MacRae，2005）。本研究從擬環(huán)紋豹蛛中克隆獲得HSP20的cDNA序列，通過Protein BLAST工具分析，預(yù)測的擬環(huán)紋豹蛛HSP20第65個氨基酸與第147個氨基酸間具有sHSP典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域，并與溫室擬肥腹蛛α-晶狀體蛋白A、桔小實(shí)蠅HSP21.6序列具有較高的相似性，表明所獲得的序列為擬環(huán)紋豹蛛小分子熱休克蛋白基因。在PpHSP20蛋白的ACD區(qū)域含有12個預(yù)測的二聚體形成接觸位點(diǎn)，可能與PpHSP20單體二聚體化有關(guān)。二聚體是sHSP形成多聚體的基本單位，而sHSP以多聚體形式執(zhí)行生物學(xué)功能為特征（Dudich et al.，1995；Brophy et al.， 1999）。

重金屬進(jìn)入細(xì)胞后能直接或間接破壞胞內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)（Stadtman and Levine， 2003； Rani et al.， 2014）。sHSP作為分子伴侶，可與脅迫造成的非正常蛋白結(jié)合，防止它們彼此聚集（Nakamoto and Vigh，2007）。已有研究表明，重金屬等環(huán)境壓力會引起生物體sHSP基因表達(dá)的改變（Sun and MacRae， 2005）。4種不同的片腳類動物Gmelinoides fasciatus、Eulimnogammarus cyaneus、E. vittatus和Ommatogammarus flavu在鎘脅迫下其sHSP基因均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)的趨勢（Shatilina et al.， 2010）。扇貝（Argopecten irradians）在Cu2+、Pb2+和Cd2+處理10 d后HSP22表達(dá)量顯著上調(diào)（Zhang et al.， 2010）。黑鯽（Carassius carassius）腎臟中HSP30表達(dá)水平與水質(zhì)變化一致，表明腎臟HSP30的表達(dá)可作為環(huán)境水質(zhì)變化的生物標(biāo)記（An et al.， 2014）。鎘是我國農(nóng)田主要的重金屬污染物，對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成了嚴(yán)重威脅（He et al.， 2013）。本研究中鎘脅迫下擬環(huán)紋豹蛛HSP20表達(dá)量明顯增加，可能與因鎘脅迫造成的結(jié)構(gòu)異常蛋白質(zhì)結(jié)合，從而在環(huán)境壓力緩解后，在其他熱休克蛋白幫助下促使這些蛋白重新折疊成正常結(jié)構(gòu)（Nakamoto and Vigh， 2007）。

4 結(jié)論

擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因編碼區(qū)長525 bp，編碼蛋白含174個氨基酸殘基，理論分子量20.08 kD，等電點(diǎn)5.97，具有親水性和小分子熱休克蛋白家族典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR分析顯示鎘脅迫下擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因表達(dá)量顯著增加，表明其在抵御鎘脅迫中發(fā)揮作用，可作為研究蜘蛛抵御鎘脅迫的重要候選基因和潛在的生物標(biāo)記物。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）