國(guó)產(chǎn)PCR試劑和COBAS系統(tǒng)血清HBV—DNA檢測(cè)結(jié)果不一致的原因分析

姜新華++高國(guó)生++胡愛榮

[摘要] 目的 探討國(guó)產(chǎn)PCR試劑和COBAS系統(tǒng)血清HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果不一致的原因。 方法 收集2013年12月～2015年10月來(lái)本院肝病中心就診的慢性HBV感染者230例，國(guó)產(chǎn)PCR試劑血清HBV-DNA結(jié)果均為陰性，應(yīng)用COBAS系統(tǒng)予以復(fù)查，分析兩種方法HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果的差異及可能的影響因素。 結(jié)果 106例（46.09%）患者兩種方法血清HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果均低于檢測(cè)下限；124例（53.91%）患者在COBAS系統(tǒng)可檢測(cè)到不同載量的HBV-DNA，包括3例（1.30%）隱匿性HBV感染。隨著患者血清HBV-DNA載量的增加，性別比、HBeAg效價(jià)和陽(yáng)性率、血常規(guī)和凝血功能等指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但血清HBsAg效價(jià)、終末期肝病構(gòu)成比、肝功能酶類指標(biāo)、AFP等逐漸升高（P<0.05）。血清HBV-DNA與HBsAg效價(jià)、肝功能指標(biāo)、AFP均有一定相關(guān)性（P<0.05），與HBeAg效價(jià)無(wú)相關(guān)性（P=0.87）。 結(jié)論 針對(duì)肝功能指標(biāo)異常、HBsAg效價(jià)較高、病情較重（特別是終末期肝?。┑穆訦BV感染患者，國(guó)產(chǎn)PCR試劑檢測(cè)血清HBV-DNA陰性時(shí)有必要應(yīng)用COBAS系統(tǒng)復(fù)查。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；脫氧核糖核酸；終末期肝?。籆OBAS Taqman系統(tǒng)；熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)] R512.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）02-0000-03

Analysis of the causes of inconsistency of serum HBV-DNA test results between homemade PCR reagent and COBAS system

JIANG Xinhua1 GAO Guosheng2 HU Airong3

1.Clinical Laboratory， Quhua Hospital in Zhejiang Province， Quzhou 324004， China； 2.Clinical Laboratory， Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， China； 3.Department of Liver Diseases， Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， China

[Abstract] Objective To explore the causes of inconsistency of serum HBV-DNA test results between homemade PCR reagent and COBAS system. Methods A total of 230 patients with chronic HBV infection who were diagnosed in the Center for Liver Diseases in our hospital from December 2013 to October 2015 were collected. The serum HBV-DNA results of homemade PCR reagents were all negative. COBAS system was applied for retest. The differences of HBV-DNA test results by both methods and the possible influencing factors were analyzed. Results The test results of serum HBV-DNA in 106 cases （46.09%） were lower than the lower limit of detection in both methods， HBV-DNA with different capacity was detected in the COBAS system in 124 patients（53.91%）， including 3 cases（1.30%） of occult HBV infection. With the increase of patients' serum HBV-DNA capacity， there was no significant difference in sex ratio， HBeAg valence and positive rate， blood routine test and coagulation function（P>0.05）. But serum HBsAg valence， end-stage liver disease ratio， liver function enzyme index， and AFP were gradually increased（P<0.05）. Serum HBV-DNA was associated with HBsAg valence， liver function index and AFP （P<0.05）， yet was not associated with HBeAg valence（P=0.87）. Conclusion In patients with chronic HBV infection who have abnormal liver function， high HBsAg valence， and severe illness（especially end-stage liver disease）， negative results of serum HBV-DNA tested by homemade PCR reagents need to be re-tested by COBAS system.

[Key words] Hepatitis B； DNA； End-stage liver disease； COBAS Taqman System； Fluorescent quantitative PCR

慢性 HBV 感染是導(dǎo)致我國(guó)終末期肝病的主要病因[1]，HBV-DNA 定量測(cè)定能準(zhǔn)確地反映病毒復(fù)制程度[2]，對(duì)慢乙肝相關(guān)疾病的診療、監(jiān)測(cè)及預(yù)后的評(píng)估均十分重要[3]。近年來(lái)國(guó)產(chǎn) HBV-DNA 檢測(cè)試劑由于采用了可靠的質(zhì)量管理體系，同時(shí)衛(wèi)計(jì)委要求PCR實(shí)驗(yàn)室均采用評(píng)審準(zhǔn)入制度，國(guó)產(chǎn)PCR試劑用于慢乙肝患者血清HBV-DNA的檢測(cè)基本可以滿足臨床需求[4]。但由于與國(guó)際參考方法（COBAS系統(tǒng)）在樣本用量、內(nèi)標(biāo)、引物等方面存在差異[5]，導(dǎo)致靈敏度和準(zhǔn)確性稍有欠缺。本文應(yīng)用COBAS系統(tǒng)對(duì)230例國(guó)產(chǎn)PCR試劑血清HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果陰性的患者予以復(fù)查，分析兩者結(jié)果不一致的可能原因，并為檢測(cè)方法的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究230例患者均為2013年12月～2015年10月來(lái)本院肝病中心就診的慢性HBV感染者，所有患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015版）[6]，HBsAg和（或）HBV-DNA陽(yáng)性6個(gè)月以上，除外其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病者。其中男167例，女63例，年齡17～81歲，平均（55.67±12.74）歲，將所有患者按血清HBV-DNA水平（COBAS系統(tǒng)）高低分為三組，A組106例（<20.00 IU/mL），B組100例（20.00～1.00×103 IU/mL），C組24例（>1.00×103 IU/mL），三組的年齡和性別比例均無(wú)明顯差異，具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法及觀察指標(biāo)

所有患者首次血清HBV-DNA檢測(cè)均采用國(guó)產(chǎn) PCR 試劑，儀器為美國(guó) ABI 7500 型熒光定量 PCR 儀。檢測(cè)結(jié)果當(dāng)日回報(bào)給臨床醫(yī)生，當(dāng)懷疑與臨床實(shí)際不相符時(shí)，當(dāng)日或次日再次采血用 Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48 系統(tǒng)及配套試劑（簡(jiǎn)稱COBAS系統(tǒng)）復(fù)查 HBV-DNA。同時(shí)檢測(cè)患者 HBV 血清標(biāo)志物、肝功能、血常規(guī)、凝血功能和甲胎蛋白（AFP）等可能影響血清HBV-DNA的指標(biāo)，HBsAg和HBeAg效價(jià)采用ABBOTT雅培AXSYM i2000全自動(dòng)免疫分析儀及配套試劑，肝功能檢測(cè)采用 Siemens ADVIA2400 全自動(dòng)生化分析儀及配套裝試劑，血常規(guī)檢測(cè)采用 Sysmex i2000全自動(dòng)血液分析儀和配套試劑，凝血功能檢測(cè)采用 ACL TOP 全自動(dòng)凝血分析儀和配套試劑，甲胎蛋白檢測(cè)采用Siemens ADVIA Centaur XP全自動(dòng)免疫分析儀和配套試劑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組均數(shù)比較采用方差分析；偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，多組均數(shù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

230例患者經(jīng)COBAS系統(tǒng)復(fù)查后，106例（46.09%）仍低于檢測(cè)下限，124例（53.91%）可以檢測(cè)到HBV-DNA（從20.93 IU/mL～大于1.70×108 IU/mL不等），特別是有24例患者高于1.00×103 IU/mL，并發(fā)現(xiàn)3例（1.30%）隱匿性HBV感染（HBsAg均為陰性，血清HBV-DNA分別為37.10 IU/mL、154.00 IU/mL、163.00 IU/mL）。

2.2 不同血清HBV-DNA水平患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

將所有患者按血清HBV-DNA水平（COBAS系統(tǒng)）高低分為三組，A組：<20.00 IU/mL，B組：20.00～1.00×103 IU/mL，C組：>1.00×103 IU/mL，隨著血清HBV-DNA的增加，患者的年齡、性別比例、HBeAg效價(jià)和陽(yáng)性率、TBil、血常規(guī)和凝血功能指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但血清HBsAg效價(jià)、終末期肝病構(gòu)成比、DBil、TP、肝功能酶類指標(biāo)（包括ALT、AST、ALP、GGT等）、AFP逐漸升高（P<0.05），而A組患者的ALB水平顯著高于B、C組（P<0.05）。見表1。

2.3 血清HBV-DNA與其他指標(biāo)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，血清HBV-DNA與HBsAg效價(jià)、肝功能指標(biāo)、AFP均有一定相關(guān)性（P<0.05）；而與HBeAg效價(jià)無(wú)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r為0.011（P=0.87）。見表2。

3 討論

監(jiān)測(cè)血清HBV-DNA的變化，對(duì)于判斷慢性 HBV 感染患者抗病毒治療的效果及預(yù)后十分重要。目前國(guó)內(nèi)血清 HBV-DNA 水平的檢測(cè)多采用國(guó)產(chǎn)試劑盒，但各廠家的方法沒有標(biāo)準(zhǔn)化，且受標(biāo)本狀態(tài)、退火溫度以及樣品中酶活性抑制物等多種因素的影響，各種檢測(cè)方法的靈敏度、精密度、檢測(cè)范圍等方面均存在差異[7]。COMBAS 系統(tǒng)作為國(guó)際參考方法，采用磁珠法提取 DNA、引物探針覆蓋高變區(qū)、設(shè)立內(nèi)參照，故具有高靈敏度、精確度和線性范圍等優(yōu)點(diǎn)[8]，但也有耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴等不適宜大范圍推廣使用的缺點(diǎn)。在臨床實(shí)踐中，部分患者采用國(guó)產(chǎn)PCR試劑的血清 HBV-DNA 檢測(cè)結(jié)果低于檢測(cè)下限，但仍有活動(dòng)性肝病的癥狀或經(jīng)過(guò)規(guī)范的抗病毒治療考慮停藥，此時(shí)有必要明確患者的病毒實(shí)際復(fù)制情況。

本文納入的230例患者經(jīng)COBAS系統(tǒng)復(fù)查后，發(fā)現(xiàn)超過(guò)一半的病例可以檢測(cè)到HBV-DNA，而且還有24例高于國(guó)產(chǎn)PCR試劑的檢測(cè)下限（1.00×103 IU/mL），后者可能是國(guó)產(chǎn)PCR試劑存在檢測(cè)盲區(qū)導(dǎo)致的假陰性[9]，而COBAS系統(tǒng)由于采用了涵蓋高變區(qū)的多對(duì)引物具備更好的檢測(cè)能力；而相當(dāng)比例的患者存在乙肝病毒低復(fù)制狀態(tài)，提示部分患者經(jīng)過(guò)規(guī)范的抗病毒治療后，即使HBV血清標(biāo)志物（特別是HBeAg）、ALT水平得到顯著控制后，仍不能隨意停藥。而且極少數(shù)患者雖然乙肝表面抗原陰性，在血清中仍可檢測(cè)到低復(fù)制的乙肝病毒，這種隱匿性HBV感染狀態(tài)為不明原因肝病的病因診斷提供了依據(jù)。

為分析哪些患者容易出現(xiàn)國(guó)產(chǎn)PCR試劑檢測(cè)陰性而COBAS系統(tǒng)陽(yáng)性，本研究將所有患者按血清HBV-DNA水平高低分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著血清HBV-DNA的增加，血清HBsAg效價(jià)、血清肝功能指標(biāo)（包括ALT、AST等）、終末期肝病比率逐漸升高，但HBeAg的效價(jià)和陽(yáng)性率均無(wú)明顯差異（而且大部分患者血清HBeAg效價(jià)較低而表現(xiàn)為HBeAg陰性狀態(tài)）；Spearman相關(guān)分析也提示血清HBV-DNA與HBsAg、ALT相關(guān)，而與HBeAg效價(jià)無(wú)相關(guān)性。一般認(rèn)為，HBeAg陽(yáng)性是HBV復(fù)制活躍、傳染性強(qiáng)的標(biāo)志，但部分患者由于前C區(qū)和/或基本核心啟動(dòng)子基因的變異導(dǎo)致e抗原分泌減少或不表達(dá)，但HBV仍不同程度復(fù)制，故此時(shí)HBeAg不能作為評(píng)價(jià)抗病毒療效以及傳染性強(qiáng)弱的依據(jù)，這與既往研究結(jié)論一致[10-12]。關(guān)于血清HBV-DNA與HBsAg效價(jià)的相關(guān)性目前存在爭(zhēng)議[13-16]，這可能與各研究納入病例的異質(zhì)性有關(guān)，正常情況下，X蛋白是乙肝病毒DNA復(fù)制過(guò)程中必需的功能蛋白[17]，在促進(jìn)HBV-DNA復(fù)制的同時(shí)，抑制S抗原表達(dá)，導(dǎo)致兩者負(fù)相關(guān)，但一旦病毒發(fā)生變異HBsAg效價(jià)的變化趨勢(shì)可能與HBV-DNA一致，本文也是如上觀點(diǎn)。HBV前C區(qū)變異與慢性HBV感染者向終末期肝病發(fā)展密切有關(guān)[18-20]，本文的觀點(diǎn)與之一致。

總之，由于國(guó)產(chǎn)PCR試劑在靈敏性、準(zhǔn)確性方面上存在缺陷，對(duì)于那些ALT水平異常、HBsAg效價(jià)較高、病情較重（特別是終末期肝病）的慢性HBV感染患者，國(guó)產(chǎn)PCR試劑檢測(cè)血清HBV-DNA陰性仍有必要考慮HBV-DNA處于復(fù)制狀態(tài)，此時(shí)COBAS系統(tǒng)不失為一個(gè)理想的選擇。

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（收稿日期：2016-06-01）