乙肝病毒檢測(cè)在臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳善昌

摘要：固相放射免疫法、反向被動(dòng)血凝改良一步法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析、實(shí)驗(yàn)微粒子酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫法、時(shí)間分辨熒光免疫法、核酸探針?lè)?、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基因芯片技術(shù)方法對(duì)檢測(cè)乙型肝炎有一定的優(yōu)越性，可為臨床診斷、用藥療效等提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。筆者對(duì)相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒；酶聯(lián)免疫吸附法；核酸探針?lè)?/p>

中圖分類號(hào)：R446.112；R512.62 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008—2409（2016）04—0166—05

1965年Blumberg發(fā)現(xiàn)“澳大利亞抗原”，隨后確定為乙肝病毒表面抗原（HBsAg），1970年英國(guó)的Dane等在電鏡下鑒定了直徑為42 nln完整的乙肝病毒顆粒，又稱為Dane顆粒，1986年被列入嗜肝DNA病毒科，并闡明了顆粒的HBsAg、HBcAg、HBeAg等成分。乙肝病毒檢測(cè)技術(shù)經(jīng)歷了20世紀(jì)60年代的放射免疫技術(shù)（RIA）、20世紀(jì)70年代的酶標(biāo)技術(shù)（ELESA）、20世紀(jì)80年代化學(xué)發(fā)光技術(shù)（CLIA）、20世紀(jì)90年代的時(shí)間分辨技術(shù)（TRFIA）及現(xiàn)在正在研究的生物芯片技術(shù)。近幾年來(lái)，隨著對(duì)乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、HBV感染與復(fù)制等研究的深入，發(fā)現(xiàn)HBV感染呈世界性分布，許多慢性感染者演變成慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化、肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康?，F(xiàn)就乙肝病毒結(jié)構(gòu)、檢測(cè)及其在臨床上的應(yīng)用綜述如下。

1乙肝病毒結(jié)構(gòu)

乙肝病毒結(jié)構(gòu)是一個(gè)具有外殼和核心兩部分完整的乙肝病毒顆粒，直徑約42nm，HBV基因組有一個(gè)約3 200 bp小環(huán)行DNA結(jié)構(gòu)，雙鏈長(zhǎng)度不對(duì)稱。外殼厚7～8 nm，由脂質(zhì)雙層和蛋白質(zhì)組成的囊膜。核心部分——含DNA和DNA聚合酶（病毒復(fù)制所需的酶），DNA分子含有約3 200個(gè)核苷酸。它包括1個(gè)長(zhǎng)度固定的負(fù)鏈和另一長(zhǎng)度不定的正鏈。正鏈開放讀碼區(qū)，不能編碼病毒蛋白。而負(fù)鏈能編碼全部已知的乙肝病毒蛋白質(zhì)，有4個(gè)開放區(qū)，分別稱為S、C、P及X，這四個(gè)開放區(qū)的開放讀碼框架為：①S基因區(qū)，由S基因和前S基因組成。S基因（核苷酸155～833）能編碼主要表面蛋白。前S基因能編碼Pre S1和Pre S2蛋白。②C基因區(qū)，由前C基因和C基因組成。分別編碼HBeAg及HBcAg。③P基因區(qū)，最長(zhǎng)，約占基因組75%以上，編碼病毒體DNA多聚酶。并具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。④X基因區(qū)，可能編碼有154個(gè)氨基酸的堿性多肽，長(zhǎng)鏈的裂口位于此區(qū)編碼HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用。

2乙肝病毒檢測(cè)方法

2.1固相放射免疫法（SPRIA）

該法是檢測(cè)乙肝表面抗原的經(jīng)典方法之一。是利用放射性同位素標(biāo)記已知抗原或抗體，使其與待測(cè)相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合部分，最好用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性強(qiáng)度，從而推算抗原或抗體含量。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性和靈敏度都較高，檢測(cè)生物活性物質(zhì)可達(dá)pg水平，比ELISA靈敏度高20倍。缺點(diǎn)：所需設(shè)備復(fù)雜，操作技術(shù)要求較高，鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)療單位難以推廣。

2.2反向被動(dòng)血凝改良一步法

反向被動(dòng)血凝法（RPHA）檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便、可對(duì)表面抗原作相對(duì)定量等優(yōu)點(diǎn)。改良一步法避免了非特異性凝集反應(yīng)，操作過(guò)程及反應(yīng)時(shí)間比反向被動(dòng)血凝法快1倍以上。節(jié)省人力和試劑，適合于常規(guī)檢查和大規(guī)模體檢的確證試驗(yàn)。在20世紀(jì)70年代至80年代，該方法檢測(cè)HBsAg在我國(guó)占據(jù)了重要地位。

2.3酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

我國(guó)在20世紀(jì)70年代開始引入該法檢測(cè)乙型肝炎標(biāo)志物，其發(fā)展迅速，很快覆蓋了醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的諸多領(lǐng)域。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)好、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，對(duì)環(huán)境和人體無(wú)危害，試劑有效期長(zhǎng)，是檢測(cè)乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物首選方法。缺點(diǎn)：抗原抗體比例不合適可引起鉤狀效應(yīng)；試劑不均一性、血清不稀釋產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)及檢驗(yàn)人員熟練程度均可影響其準(zhǔn)確性，影響檢測(cè)結(jié)果因素較多。

2.4膠體金免疫層析實(shí)驗(yàn)（GICA）

該法是以膠體金作為標(biāo)志物，利用層析作用檢測(cè)抗原或抗體。與ELISA比優(yōu)點(diǎn)：可測(cè)末梢全血或血清，用量少、簡(jiǎn)便、快速、不需儀器設(shè)備，尤其為無(wú)償獻(xiàn)血者現(xiàn)場(chǎng)采血前的檢測(cè)，提供了便利條件。缺點(diǎn)：靈敏度較低于ELISA，弱陽(yáng)性標(biāo)本容易漏檢。有學(xué)者采集40份標(biāo)準(zhǔn)血清分別使用以下3種方法進(jìn)行檢測(cè)，電化學(xué)發(fā)光法檢出的陽(yáng)性率為65%，靈敏度100%；進(jìn)口試劑盒ELISA法的陽(yáng)性率為65%，靈敏度100%；國(guó)產(chǎn)試劑盒ELISA法的陽(yáng)性率為50%，靈敏度76.9%；膠體金免疫層析法的陽(yáng)性率為22.5%，靈敏度僅為34.6%。

2.5微粒子酶免疫分析（MEIA）

此法檢測(cè)表面抗原是目前世界上檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)記物的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)HBsAg檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.17～0.20 ng/ml，優(yōu)點(diǎn)是：全自動(dòng)檢測(cè)，人為造成誤差因素少，抗干擾能力強(qiáng)，重復(fù)性好，可單份檢測(cè)，對(duì)病情可做動(dòng)態(tài)檢測(cè)。缺點(diǎn)：儀器和試劑成本較高，基層醫(yī)院難于普及。

2.6化學(xué)發(fā)光免疫法（ECLIA）

隨著電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)發(fā)光應(yīng)用到臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)，該方法學(xué)使用固相載體為順磁性微粒，擴(kuò)大了反應(yīng)面積，同時(shí)由于標(biāo)志物的循環(huán)利用，延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，增加強(qiáng)度，大大提高了檢測(cè)靈敏度，能檢出低濃度至0.13 ng/ml的HBsAg，對(duì)于控制傳染源、流行病學(xué)及監(jiān)測(cè)HBV復(fù)制狀態(tài)和評(píng)價(jià)抗病毒治療效果有重要作用。

2.7時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）

該法是我國(guó)近年來(lái)較多臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)乙肝兩對(duì)半最有潛力的一種標(biāo)記免疫分析方法。其熒光壽命延長(zhǎng)了，降低了本底因素影響，特異性和穩(wěn)定性都有顯著提高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種指標(biāo)的檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)放射物質(zhì)危害，不受自然熒光干擾，避免了人為因素引起的加樣誤差和鉤狀效應(yīng)產(chǎn)生，靈敏度和特異性強(qiáng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好，能動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情及HBsAb的定量測(cè)定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用。缺點(diǎn)：檢測(cè)所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法快速檢測(cè)，且費(fèi)用較高，不利于基層以下醫(yī)院開展。TRFLA法與ELISA法比較：TRFLA法能檢測(cè)低濃度HBsAg攜帶者，能在急性乙肝早期檢出HBsAg，而ELISA法實(shí)驗(yàn)時(shí)間雖然較短，但如果標(biāo)本中HBsAg濃度過(guò)高會(huì)因鉤狀效應(yīng)導(dǎo)致漏檢。

2.8核酸探針?lè)?/p>

核酸探針技術(shù)是屬于生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)先進(jìn)檢測(cè)手段，我國(guó)20世紀(jì)80年代末90年代初發(fā)展起來(lái)的分子微生物學(xué)技術(shù)。特點(diǎn)：敏感性和特異性較強(qiáng)。大量研究顯示，核酸探針?lè)z出HBV-DNA的陽(yáng)性率顯著高于ELISA法檢出的HB eA g的陽(yáng)性率。

2.9多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)此法由Saiki首次提出，我國(guó)在20世紀(jì)90年代初廣泛應(yīng)用，是一種模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程，在體外擴(kuò)增特異性DNA（或RNA）片段的新技術(shù)?？煞譃槎ㄐ院投?，其敏感性及特異性比核酸探針?lè)ǜ鼜?qiáng)。錢宇等研究報(bào)道，免疫蒙光定量PCR方法直接測(cè)定病毒量，明確反映病毒感染程度，其測(cè)定值與ALT呈一定程度正相關(guān)，與肝炎輕、中、重程度及肝纖維化程度成反比。

2.10基因芯片技術(shù)

又稱DNA芯片、生物芯片，是目前研究領(lǐng)域的新檢測(cè)技術(shù)。具有高通量、快速等特點(diǎn)，在病毒基因表達(dá)譜的研究、病毒流行學(xué)的研究等方面得到廣泛的應(yīng)用。

3乙肝病毒檢測(cè)在臨床的應(yīng)用價(jià)值

乙型肝炎嚴(yán)重危害人類健康，我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，目前，乙型肝炎病毒（hepatitis vi-rus B，HBV）攜帶者在我國(guó)已有1.3億人，約占總?cè)丝诘?/10。約25%的感染者發(fā)展成為慢性乙型肝炎（簡(jiǎn)稱乙肝）。其中慢性乙型肝炎是發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重危害我國(guó)人民的健康水平和生活質(zhì)量。乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物為檢測(cè)乙型病毒感染的最主要病原標(biāo)志和直接證據(jù)之一。乙肝兩對(duì)半檢查項(xiàng)目包括：乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗體（HBsAb）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（HBeAb）及乙肝核心抗體（HBcAb）。在病毒感染緩解和愈合的不同時(shí)期，可有不同的模式存在。

3.1乙肝兩對(duì)半各種模式的臨床意義

乙肝兩對(duì)半各種模式的臨床意義見表1。

3.2乙肝兩對(duì)半各項(xiàng)的臨床意義

3.2.1乙肝表面抗原 乙肝表面抗原是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標(biāo)志。臨床意義：是乙型肝炎病毒感染的早期診斷指標(biāo)，陽(yáng)性為已經(jīng)感染病毒的標(biāo)志，并不反映病毒復(fù)制和傳染性的強(qiáng)弱，陰性也不能排除乙型肝炎病毒感染。

3.2.2乙肝表面抗體 當(dāng)人體受到乙型肝炎病毒侵入后，刺激人的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，人體免疫系統(tǒng)中的B淋巴細(xì)胞分泌出一種特異的免疫球蛋白G。它可以和表面抗原特異地結(jié)合，在體內(nèi)與人體的其他免疫功能共同作用下，可清除病毒，保護(hù)人體不再受乙肝病毒感染，故稱表面抗體為保護(hù)性抗體。臨床意義：為中和性抗體標(biāo)志，是否康復(fù)或是否有抵抗力的主要標(biāo)志。陽(yáng)性見于既往感染已好轉(zhuǎn)或接種乙肝疫苗，對(duì)乙型肝炎病毒感染具有保護(hù)作用。

3.2.3乙肝e抗原 乙肝e抗原是乙型肝炎病毒的核心，是核心抗原裂解后的產(chǎn)物。其臨床意義為：陽(yáng)性為病毒復(fù)制標(biāo)志，病毒復(fù)制活躍，傳染性強(qiáng)，持續(xù)陽(yáng)性3個(gè)月以上則有慢性化傾向。HBeAg陽(yáng)性與乙肝病毒的復(fù)制程度呈正相關(guān)，HBeAg是HBV高度傳染性的指標(biāo)。黃建煒等研究，HBeAg陽(yáng)性標(biāo)志著HBV的高水平復(fù)制，但HBeAg陽(yáng)性者僅占HBV攜帶者總數(shù)的21.7%，與HBVDNA陽(yáng)性符合率39.5%，低于HBsAg（79.8%）。

3.2.4乙型肝炎e抗體 乙型肝炎e抗體是由e抗原刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生出來(lái)的特異性抗體，這種特異性e抗體能夠和e抗原結(jié)合。臨床意義：陽(yáng)性說(shuō)明病毒復(fù)制減少，或病毒復(fù)制停止標(biāo)志，傳染性較弱但，e抗體陽(yáng)性不是保護(hù)性抗體，患者沒(méi)有抗乙肝病毒的免疫力。

3.2.5乙肝核心抗體 血清中核心抗原刺激身體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生出特性抗體，即核心抗體，通過(guò)檢測(cè)乙肝核心抗體可以了解人體是否有過(guò)乙肝病毒的感染。臨床意義：乙肝核心抗體是一項(xiàng)病毒感染的標(biāo)志。陽(yáng)性為曾感染或感染期出現(xiàn)的標(biāo)志。且乙肝病毒復(fù)制活躍、是傳染性強(qiáng)的指標(biāo)之一。對(duì)于輔助兩對(duì)半檢查有一定意義。

4乙肝病毒DNA及基因分型檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用價(jià)值

乙肝病毒DNA定量檢測(cè)在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣，HBV DNA值更能準(zhǔn)確、靈敏地反映HBV病毒復(fù)制的程度。體內(nèi)有無(wú)HBV復(fù)制最好通過(guò)乙肝五項(xiàng)指標(biāo)及HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果提示來(lái)判斷患者的免疫恢復(fù)、病情分期或排除HBV感染的存在才能為患者的病情提供較為準(zhǔn)確的判斷，較好地為臨床合理治療用藥提供依據(jù)。乙肝病毒DNA定量檢測(cè)指標(biāo)降低是乙肝轉(zhuǎn)陰的前奏，也是康復(fù)最為關(guān)鍵的一步，只有體內(nèi)的乙肝病毒DNA定量指標(biāo)降低，乙肝病毒的復(fù)制繁殖才會(huì)停止，乙肝的徹底治愈才有希望，因此，熒光定量PCR檢測(cè)乙肝病毒DNA，為臨床醫(yī)生對(duì)乙型肝炎傳染性的判斷、用藥療效的監(jiān)測(cè)及預(yù)后的判斷提供了診斷依據(jù)。乙肝病毒定量檢測(cè)，對(duì)治療前進(jìn)行檢測(cè)可以指導(dǎo)選擇對(duì)癥藥品，避免盲目用藥；對(duì)治療后定量PCR檢測(cè)可直接正確地測(cè)定體內(nèi)乙肝病毒數(shù)目，有助于用藥療效的判定及指導(dǎo)用藥。王永忠等對(duì)146份急慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中HBV DNA基因分型研究結(jié)果，肝硬化和肝癌患者主要為C基因型感染，顯著高于慢性乙型肝炎患者，（X²=7.65，P=0.01）。姚光弼等的研究報(bào)道，ALT反跳合并有HBVDNA的反跳患者有38.7%，而HBV DNA反跳時(shí)合并有ALT的反跳的患者只有18.5%，HBV DNA的反跳與ALT的反跳似乎沒(méi)有必然的聯(lián)系。

綜上所述，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）靈敏度高、特異性強(qiáng)，成本較低，適合于血站、綜合醫(yī)院等標(biāo)本量大的醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展；膠體金免疫層析法適合于快速檢測(cè)時(shí)使用；微粒子酶免疫分析（MEIA）、化學(xué)發(fā)光免疫法（ECLIA）和時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）因成本較高，適合于經(jīng)濟(jì)條件較好的醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室開展。乙型肝炎標(biāo)志物檢測(cè)方法各有優(yōu)越性，檢驗(yàn)的目的是為臨床服務(wù)，因此，各臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該根據(jù)自己條件及臨床醫(yī)生的要求來(lái)選擇檢測(cè)方法，為臨床診斷、用藥療效等提供準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。