NLRP3炎癥小體在高脂誘導大鼠冠狀動脈硬化性心臟病形成中的表達水平及意義

王全河，翟關(guān)群

隨著人們生活水平的提高，高脂飲食的危害性日益明顯，冠狀動脈硬化性心臟?。ü谛牟。珻AD）發(fā)病率也逐年增加[1]，且呈年輕化趨勢[2]，對患者、家庭及社會造成了嚴重負擔[3]。深入研究冠心病的形成機制，對于有效預防其形成、降低發(fā)病率，具有重要意義。目前高血脂刺激活性氧（ROS）生成增多被認為是CAD發(fā)生和發(fā)展的重要原因[4]。過多的ROS刺激多種炎癥因子表達升高，如核因子kB（NF-kB）、硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）等，促使動脈粥樣硬化形成。研究表明，NLRP3炎癥小體與動脈粥樣硬化關(guān)系密切[5]，研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3可在CAD形成中出現(xiàn)異常表達，推測NLRP3炎癥小體參與了CAD的發(fā)生及發(fā)展，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料實驗大鼠購自重慶醫(yī)科大學動物研究所，所有的動物護理和程序符合美國國立衛(wèi)生研究院的指導方針，且符合相關(guān)倫理學規(guī)定。血脂指標測定采用通過瑞文醫(yī)療生化分析儀（型號XR420A），NLRP3抗體購自博爾西（Bersee），BCA蛋白試劑盒品牌：Solarbio （貨號：PC0020），RIPA裂解液購自Bosterbio（貨號：AR0105）,bio-Rad Mini V垂直電泳儀和Trans Blot儀（GE公司），PCR儀品牌Thermo Fisher，Trizol試劑，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CAD動物模型制備雄性SD大鼠（210～220 g，6周）共160只，飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，并予以正常飲食及飲水，直至可自由采食1周。將實驗動物稱重后并編號處理，采用隨機數(shù)字表法分為4組：對照組（Control組40只）、高脂飲食（A組40只）、高脂飲食+空載體慢病毒組（B組40只）、高脂飲食+NLRP3-miRNA慢病毒組（C組40只）。除Control組單純喂養(yǎng)基礎飼料外，其余三組均為基礎飼料+高脂飲食（高脂飲食為3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油）。同時除對照組外其余實驗大鼠每日清晨8:00給予維生素D3（Vitamin D3）300 000 IU/kg肌肉注射并予尼古丁（Nicotine）25 mg/kg溶于2 ml花生油中灌胃，晚6:00予尼古丁25 mg/kg溶于花生油中再次灌胃，Control組予生理鹽水肌注和花生油灌胃處理。通過RNAi干擾技術(shù)構(gòu)建沉默率最高的質(zhì)粒，最終構(gòu)建pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體，實驗第8周B組實驗大鼠腹腔注射慢病毒空載體，C組腹腔注射pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體，其余組分別注射等量生理鹽水，共干預8周，所有實驗動物均飼養(yǎng)16周。

1.2.2 NLRP3炎性小體及蛋白白介素-1β（IL-1β檢測）分別于正常飼養(yǎng)第1 d、高脂飲食第4周、第8周、第12周及第16周各組分別斷頸法處死大鼠5只，通過RT-qPCR及Western Blot檢測大鼠心肌組織中NLRP3炎性小體其作用蛋白IL-1β表達水平進行檢測。

1.2.3 血清學檢測分別于正常飼養(yǎng)第1 d、高脂飲食第4周、第8周、第12周、第16周抽取大鼠股動脈血，經(jīng)肝素抗凝及高速離心（2000 r/min）處理后，分離血漿，注入已加好的10% EDTANa2（1.5 mg/ml） 30 μl（乙二胺四乙酸二鈉）及Aprotinin（500 kiu/ml）20 μl（胰蛋白酶抑制液溶液）的EP管中，-80℃凍存?zhèn)溆茫瑫r測定總膽固醇（TC）及三酰甘油（TG）。

1.2.4 心肌組織及冠狀動脈病理切片各組16周時處死大鼠5只并獲取冠狀動脈5 mm及心臟橫斷面組織，組織離體后用10%的formalin固定，HE染色后觀察冠狀動脈壁斑塊沉積和心肌細胞脂質(zhì)沉積情況評價造模情況。

1.2.5 心功能評價實驗動物分別于正常飼養(yǎng)第1 d、高脂飲食第4周、第8周、第12周、第16周通過心臟彩超測量，包括左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd），左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs），左室舒張末期室間隔厚度（IVSd），左室射血分數(shù)（LVEF），左心室舒張期容積（LVEDV）等。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗，當理論頻數(shù)＜5時，采取Fishe精確概率法檢驗，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 NLRP3炎癥小體及蛋白IL-1β的表達通過RT-qPCR及Western Blot檢測心肌組織中NLRP3炎性小體表達情況，發(fā)現(xiàn)在高脂飲食組大鼠的心肌組織中NLRP3蛋白表達水平及mRNA水平均明顯高于對照組（P＜0.01）（圖1），IL-1β表達水平及mRNA水平亦明顯高于對照組（P＜0.01）（圖2）；通過RNAi干擾技術(shù)對NLRP3蛋白表達進行沉默干預8周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該組大鼠（C組）心肌組織中NLRP3蛋白、IL-1β蛋白表達水平及mRNA水平較未干預高脂飲食組（A組及B組）大鼠表達水平下降（P＜0.05）。

圖1 心肌組織中NLRP3炎性小體蛋白表達水平及mRNA表達水平測定

圖2 心肌組織中IL-1β蛋白表達水平及mRNA表達水平測定

2.2 各組大鼠的血脂變化根據(jù)實驗設計在不同時間點位，對4組實驗大鼠血液中的TC及TG進行檢測后發(fā)現(xiàn)，分別三組高脂飲食大鼠（A組、B組及C組）與對照組大鼠相比血漿中的TC和TG水平均顯著升高（P＜0.05）；而進行慢病毒干預處理后C組大鼠在干預后8周，TC及TG水平較A組下降（表1）。

2.3 大鼠心肌改變情況16周時處死大鼠，通過組織切片檢測發(fā)現(xiàn)，對照組正常飲食的大鼠冠狀動脈僅出現(xiàn)少量粥樣硬化斑塊，而在另外三組高脂飲食大鼠中均出現(xiàn)了明顯的粥樣硬化斑塊（圖3A）；高脂飲食實驗的大鼠心肌細胞切片觀察后發(fā)現(xiàn)，其心肌細胞明顯腫脹并伴纖維組織增生（圖3B），符合冠心病的心肌病理改變。同時經(jīng)RNAi干擾技術(shù)沉默處理的大鼠（C組）其冠狀動脈粥樣硬化斑塊程度低于A組；通過對大鼠左心室重量稱重并比較左心室重量/體重比值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組高脂飲食組大鼠左心室重量/體重比值較對照組均明顯增加（P＜0.01）；RNAi干擾技術(shù)沉默組大鼠（C組）左心室重量/體重比值較高脂飲食組（A組）降低（P＜0.05） （圖3C）。

圖3 各組大鼠冠脈心肌組織病理切片及左心室/體重比值檢測結(jié)果

2.4 大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能評價通過對各組實驗大鼠不同時間點位的心臟彩超發(fā)現(xiàn)：實驗組4周后逐漸出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)改變，16周時，與正常飲食的大鼠相比，高脂飲食大鼠心臟腔室明顯增大，且心臟功能隨高脂飲食的時間延長而出現(xiàn)功能下降（P＜0.05），經(jīng)RNAi干擾技術(shù)沉默處理的大鼠中心臟增大的情況較高脂飲食組（A組）降低，而心臟功能有所恢復（P＜0.05）。

3 討論

表1 各組實驗大鼠的TC與TG水平檢測（mmol/L，±s）

表1 各組實驗大鼠的TC與TG水平檢測（mmol/L，±s）

注：TC：總膽固醇；TG：三酰甘油

組別 control組（n=20） A組（n=20） B組（n=20） C組（n=20）TC TG TC TG TC TG TC TG 1 d 1.50±0.12 0.42±0.16 1.48±0.13 0.31±0.12 1.51±0.15 0.41±0.11 1.47±0.16 0.38±0.14 4 W 1.51±0.13 0.40±0.13 5.35±1.15 0.95±0.14 4.98±1.06 1.01±0.22 5.11±1.06 0.98±0.23 8 W 1.57±0.15 0.44±0.15 13.51±3.21 1.59±0.85 14.78±2.79 1.57±0.55 13.96±2.05 1.39±0.32 12 W 1.52±0.14 0.43±0.12 17.52±2.58 2.25±0.98 18.32±2.37 2.39±1.02 16.30±1.68 1.67±0.85 16 W 1.61±0.18 0.45±0.17 21.75±2.21 3.20±1.05 20.38±1.95 3.37±1.12 18.52±1.63 2.78±1.01

表2 各組大鼠在不同時段心臟超聲檢測結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠在不同時段心臟超聲檢測結(jié)果（±s）

注：LVIDd：左室舒張末期內(nèi)徑；LVIDs：左室收縮末期內(nèi)徑；IVSd：左室舒張末期室間隔厚度；LVEF：左室射血分數(shù)；LVEDV：左室舒張期容積

組別 指標 1 d 4周 8周 12周 16周control組 LVIDd（mm） 6.12±0.68 5.78±0.53 6.58±0.85 6.38±0.71 6.75±1.01 LVIDs（mm） 3.21±0.47 3.07±0.36 3.47±0.62 3.52±0.53 3.76±0.71 IVSd（mm） 1.92±0.22 1.85±0.15 2.03±0.37 1.97±0.31 2.32±0.54 LVEF 80.32±8.65 76.68±6.02 83.16±10.08 82.34±9.24 86.59±11.26 LVEDV（mL） 210.89±43.62 206.37±40.43 215.69±49.31 212.32±45.62 220.61±51.75 A組 LVIDd（mm） 6.45±0.82 5.83±0.92 6.21±0.98 7.12±0.71 9.02±0.75 LVIDs（mm） 3.47±0.61 2.75±0.78 1.89±1.34 3.21±0.23 6.31±0.61 IVSd（mm） 1.89±0.11 2.35±0.21 3.21±0.41 2.58±0.15 2.01±0.30 LVEF 79.56±7.86 86.32±6.29 90.85±8.81 80.01±3.21 60.36±2.58 LVEDV（mL） 215.62±45.38 201.21±50.61 160.43±53.21 250.39±60.31 380.56±110.78 B組 LVIDd（mm） 5.95±0.53 6.12±0.98 6.09±0.72 7.42±0.92 8.52±0.51 LVIDs（mm） 3.27±0.51 2.85±0.85 2.01±1.56 3.58±0.46 5.97±0.41 IVSd（mm） 1.81±0.09 2.41±0.32 3.48±0.57 2.46±0.12 1.98±0.18 LVEF 76.25±6.21 87.33±7.21 92.35±9.91 75.32±2.58 63.52±5.37 LVEDV（mL） 209.35±42.22 216.31±56.84 170.85±60.21 240.71±50.32 371.41±90.71 C組 LVIDd（mm） 6.01±0.73 6.14±0.78 6.72±0.84 6.79±0.62 7.01±0.81 LVIDs（mm） 3.51±0.76 3.45±0.97 2.78±1.76 3.21±0.78 4.05±0.81 IVSd（mm） 1.92±0.18 2.51±0.41 3.46±0.53 3.04±0.72 2.71±0.69 LVEF 80.32±8.94 85.28±5.68 94.72±8.91 79.47±7.92 75.21±5.22 LVEDV（mL） 219.85±51.21 220.21±60.21 180±51.23 210.97±53.21 266.78±59.84

CAD已成為導致人類死亡病因中的首位疾病。目前已證實該疾病與脂質(zhì)代謝異常關(guān)系密切[6]，最終造成心臟形態(tài)及功能改變及不良事件發(fā)生。近年發(fā)現(xiàn)非特異性炎癥與血脂異常關(guān)系密切[7]，深入開展非特異性炎癥導致血脂異常進而促進CAD的研究，對于有效防控CAD有著重要意義。

NLRP3炎性小體是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與機體免疫反應和疾病發(fā)生[8]，已有研究證實NLRP3炎癥小體在許多疾病中扮演重要角色，如家族性周期性自身炎癥反應、2型糖尿病、慢性肝病、慢性肺部疾病等[9,10]，但遺憾的是NLRP3炎性小體與冠心病相關(guān)報道少見，具體機制亦不明確，尚需進一步研究。

我們通過高脂飲食誘導制備大鼠冠心病動物模型并對NLRP3炎性小體表達水平及其對心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常飲食的大鼠相比，高脂飲食大鼠血脂水平顯著升高（P＜0.05）；且冠狀動脈均不同程度的出現(xiàn)粥樣硬化斑塊。同時通過實驗發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體蛋白表達水平及mRNA水平在高脂飲食組明顯升高，其作用蛋白IL-1β表達水平及mRNA水平也出現(xiàn)了明顯增高；結(jié)合心臟彩超對大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能進行評價,我們高脂飲食大鼠心臟形態(tài)明顯增大且心臟功能明顯下降（P＜0.05），為驗證是否NLRP3炎性小體表達水平與心臟結(jié)構(gòu)和功能以及冠狀動脈粥樣硬化程度相關(guān)，我們通過RNAi干擾技術(shù)沉默技術(shù)對高脂飲食大鼠進行了處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體表達水平的下降后，大鼠冠狀動脈粥樣硬化斑塊程度有所減輕且心臟結(jié)構(gòu)和功能有所改善，推測其機制可能為下調(diào)NLRP3炎癥小體水平從而調(diào)控其作用蛋白IL-1β延緩血管內(nèi)皮損傷，抑制血管內(nèi)皮的非特異性炎癥的發(fā)生[11]，從而改善心臟功能。

綜上所述，冠狀動脈硬化型心肌病中NLRP3炎癥小體蛋白表達水平及mRNA水平明顯升高，與CAD的心臟結(jié)構(gòu)改變、心臟功能及冠狀動脈粥樣硬化程度相關(guān)，下調(diào)其表達水平可以改善CAD的心臟改變，改善心臟功能及冠狀動脈粥樣硬化程度。