醛固酮誘導(dǎo)p21依賴性腎臟衰老的機(jī)制

范愈燕，孫永新，劉青山，周亦倫，李平，梁秉中

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇醫(yī)院疼痛科，北京 100050； 2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，沈陽 110001； 3.中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100030； 4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100050； 5.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029； 6.香港中文大學(xué)中醫(yī)中藥研究所，香港 999077）

動物實驗和臨床研究［1-4］發(fā)現(xiàn)，醛固酮在腎臟的生理病理中發(fā)揮著非常重要的作用。醛固酮可以誘導(dǎo)大鼠的腎臟的損傷和衰老，可能是通過醛固酮受體和p21依賴的途徑所致。血管衰老與載脂蛋白E基因 （apoE-敲除的小鼠） 動脈粥樣硬化的進(jìn)展有關(guān)，而p21基因缺失，會減輕衰老和動脈硬化改變［5］，說明p21與血管的衰老密切相關(guān)。醛固酮可誘導(dǎo)多種細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞［6］、血管平滑肌細(xì)胞［7］、腎上皮細(xì)胞［8］的p21上調(diào)。雖然以往實驗［9］已經(jīng)初步證實p21缺乏可以減少腎皮質(zhì)衰老，但醛固酮是否通過p21調(diào)節(jié)腎臟的衰老而加速了腎臟的損害機(jī)制，仍需要進(jìn)一步明確。因此本研究探討了醛固酮誘導(dǎo)腎臟衰老和損害的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：采用人近端腎小管上皮細(xì)胞的永生系細(xì)胞株ImHPTCs，該細(xì)胞由AKRIA NISHIYAMA 香川大學(xué)贈予，保持HPTCs基本生物學(xué)特性。

1.1.2 實驗動物：4周齡的p21（-/-）小鼠和 （FVB） 野生型小鼠均由維通利華公司配殖提供。

1.1.3 主要試劑：RPMI-1640 培養(yǎng)液 （美國Quality Biological公司）；胎牛血清FBS （美國Gibico公司）；siRNAs 的靶基因p21 and MR （美國Santa Cruz公司）；N-acetyl L-cysteine （美國 MedChem Express 公司）；β-Gal （pH6.0） ，染色液 （1 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷，5 mmol/L亞鐵氰化鉀，150 mmol/L氯，2 mmol/L 氯化鎂，0.01% 脫氧膽酸鈉，0.02%-40 Nonidet）；p21 （美國BioSource International公司） ，MR （美國Santa Cruz公司）；脂質(zhì)體2000 （美國Invitrogen公司）；5’-Bromo-2’-deoxyuridine （美國Sigma公司） 。

1.2 方法

1.2.1 模型制作、分組和給藥方法：模型制作見參考文獻(xiàn)［1］和［4］。小鼠體質(zhì)量50 g，給予戊巴比妥鈉（20 mg/kg，IP） 麻醉，1%NaCl飲水，隨機(jī)分為以下2組：（1）對照組，F(xiàn)VB小鼠［n = 10，2%乙醇 + 醛固酮 0.6 g / （kg·d）］；（2）實驗組，p21（-/-）小鼠組［n = 10，2%乙醇 + 醛固酮 0.6 g/ （kg·d） ］。其中醛固酮和乙醇均采用皮下滲透微泵 （北京拜安吉科技有限公司） 置于肩胛間皮下泵入，每2周在麻醉下更換滲透微泵，每只小鼠共應(yīng)用3個滲透微泵，實驗時間為5周。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：溫度敏感SV40的含腺病毒LTAn抗原永生化人的近曲小管細(xì)胞ImHPTCs細(xì)胞珠生長在Click’s Medium培養(yǎng)基中 ［（RPMI-1640 1∶1 （美國Quality Biological公司） ，含1% insulin- transferrin-selenium，40 ng/mL地塞米松，10 ng/mL表皮生長因子，2%胎牛血清 （FBS） ，2%青霉素，鏈霉素］，在33 ℃，5%CO2完全飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.3 β-Gal染色：6孔板內(nèi)細(xì)胞給予藥物刺激后2 h，用PBS沖洗2次，在37 ℃新配置的1 mg/mL β-Gal（pH6.0） 染色液中培養(yǎng)并染色，染色后于100倍的顯微鏡下觀察衰老的細(xì)胞［8］。室溫下2%甲醛/0.2%戊二醛中固定腎臟組織3～5 min，用PBS沖洗2次，在37℃新配置的1 mg/mL β-Gal （pH6.0） 染色液中培養(yǎng)并染色。染色后，將組織固定在OCT 中冷凍保存。在低溫下將冷凍組織切為5～6 mm的薄片，進(jìn)行PAS染色。在100倍的顯微鏡下進(jìn)行衰老細(xì)胞計數(shù)，在每張載玻片中隨機(jī)選擇5個領(lǐng)域，計數(shù)胞質(zhì)中有藍(lán)色沉淀的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.2.4 實時 PCR：通過實時PCR方法檢測細(xì)胞中β-actin、p21、腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor α，TNF-α）、膠原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型 （collagenⅠ和 collagenⅢ） mRNA的表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用SYBR GreenⅠ試劑盒 （美國Applied Biosystems公司） 行實時PCR，然后應(yīng)用ABIPrism 7000序列檢測系統(tǒng) （美國Applied Biosystems公司）測序，各引物序列見表1。以β-actin作為內(nèi)參照，分別計算每個靶基因與β-actin的比值。

表1 基因擴(kuò)增引物序列Tab.1 Oligonucleotide primer sets used for gene amplification

1.2.5 RNA 干擾：將p21和MR的小RNA通過脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)30%～50%的亞融合狀態(tài)，在無抗菌素存在的條件下，向6孔的培養(yǎng)皿每孔中加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（含3.5的脂質(zhì)體2000和100 pmoL siRNA），培養(yǎng)8 h后再更換為原培養(yǎng)液。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，計量資料組間比較采用ANOVA方差分析通過Bonferroni’s test，半定量資料組間數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醛固酮誘導(dǎo)人腎臟近曲小管細(xì)胞的衰老變化

醛固酮誘導(dǎo)使TSImHPTCs的β-Gal活性明顯升高，而升高的活性沒有受到對照組的爭奪載體轉(zhuǎn)染影響，而是被p21和MR的siRNA明顯抑制。通過這些離體實驗的數(shù)據(jù)證明，醛固酮可能是通過MR/p21依賴的途徑誘導(dǎo)了腎臟細(xì)胞衰老，見圖1A。

2.2 細(xì)胞衰老對細(xì)胞纖維化基因表達(dá)的影響

圖1 醛固酮誘導(dǎo)腎臟近曲小管細(xì)胞的衰老變化Fig.1 Changes in the expression of aldosterone-induced renal senescence genes in immortalized human proximal tubular cells

評估細(xì)胞衰老在細(xì)胞凋亡和纖維化的分子表達(dá)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 nmol/L濃度醛固酮使TSIm-HPTCs TNF-α、Ⅰ和Ⅲ型膠原的基因表達(dá)顯著增加（圖1B～D） ，這些變化被p21基因siRNA的轉(zhuǎn)染所抑制，表明細(xì)胞衰老參與腎臟的損傷過程與p21通路有關(guān)。

2.3 醛固酮誘導(dǎo)p21 （-/-） 小鼠腎內(nèi)β-Gal活性變化

采用醛固酮誘導(dǎo)正常的FBV小鼠和p21（-/-）小鼠，觀察腎臟組織的衰老變化。發(fā)現(xiàn)醛固酮有效地誘導(dǎo)了正常FBV小鼠腎臟組織β-Gal活性 （圖2A） 的增加，在近曲小管細(xì)胞尤為顯著；而p21（-/-）小鼠腎小球的β-Gal染色面積，即活性表達(dá)明顯減少。進(jìn)一步證明醛固酮誘導(dǎo)了p21依賴性、非高血壓依賴性的腎組織衰老機(jī)制。

2.4 醛固酮誘導(dǎo)p21 （-/-） 小鼠腎內(nèi)纖維化基因的表達(dá)

采用醛固酮誘導(dǎo)正常的FBV小鼠和p21（-/-）小鼠，觀察腎臟組織纖維化的變化。 醛固酮顯著誘導(dǎo)了正常FBV小鼠腎臟組織的TNF-α、Ⅰ和Ⅲ型膠原的基因表達(dá) （圖2B、C） ，而醛固酮誘導(dǎo)的p21（-/-）小鼠腎臟組織的纖維化卻明顯減輕，說明醛固酮誘導(dǎo)的大鼠腎臟損害是通過p21通路實現(xiàn)的。

3 討論

醛固酮是一種重要的調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡的激素。之前的實驗［1，5］也證明，醛固酮可誘導(dǎo)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，與腎組織的衰老密切相關(guān)，特別是腎小管上皮細(xì)胞，其損傷性可能是通過MR/超氧化物/p21依賴/非血壓依賴的途徑進(jìn)行調(diào)控。本研究采用體外p21轉(zhuǎn)基因小鼠和體內(nèi)細(xì)胞實驗進(jìn)一步驗證醛固酮誘導(dǎo)腎臟衰老的p21依賴性機(jī)制。

眾所周知，當(dāng)細(xì)胞暴露在壓力狀態(tài)下，可通過多種途徑保護(hù)其分化［11-12］。作為一種外在的壓力，醛固酮在改變細(xì)胞凋亡的命運、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或衰老中的作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和增加TNF-α和膠原蛋白表達(dá)，這個結(jié)果與以前的文獻(xiàn)報道［13］一致，說明醛固酮可增強(qiáng)自分泌/旁分泌的凋亡/炎癥和纖維化信號表達(dá)。重要的是，這些增加的信號會因p21基因的敲除而減少，這表明醛固酮誘導(dǎo)的TNF-α和膠原蛋白表達(dá)的變化可能是p21依賴性細(xì)胞衰老。醛固酮、細(xì)胞衰老和凋亡之間詳細(xì)的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

圖2 醛固酮誘導(dǎo)p21 （-/-） 小鼠腎內(nèi)β-Gal活性變化及腎臟皮質(zhì)纖維化改變Fig.2 Changes in β-Gal activity and in collagen I and collagen III mRNA levels in aldosterone-induced p21 （-/-） mice

臨床研究［14-15］表明，老年人捐助腎臟進(jìn)行移植的生存率低，且在腎臟移植的腎病患者中p21表達(dá)增加［16］。這樣的證據(jù)可能反映了一種假說，即衰老的腎臟更容易感受各種疾病，特別是腎小管功能更易于受到影響，如急性腎損傷和慢性腎病進(jìn)展性尿蛋白，原因是腎小管修復(fù)活動減少［17-21］。因此，為了進(jìn)一步證明這個假說，本研究采用p21（-/-）小鼠和正常FBV小鼠，分別泵入醛固酮，觀察腎臟皮質(zhì)中β-Gal、膠原蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常FBV小鼠的腎臟皮質(zhì)在醛固酮的誘導(dǎo)下，β-Gal和膠原蛋白基因表達(dá)顯著增加，而p21（-/-）小鼠腎臟皮質(zhì)中則表達(dá)減弱。因此，進(jìn)一步證明了醛固酮誘導(dǎo)膠原蛋白表達(dá)的變化可能是p21依賴的細(xì)胞衰老的假說。

總之，醛固酮誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞β-Gal高表達(dá)，表明腎小管是醛固酮誘導(dǎo)腎功能衰老的靶器官，慢性醛固酮的暴露可能導(dǎo)致p21依賴性腎功能不全的發(fā)生和發(fā)展。在目前的臨床研究中尚未提及的一個重要的問題為醛固酮增多癥患者是否出現(xiàn)腎臟衰老變化，這些變化是否可以被MR阻斷劑的藥理作用所治療或預(yù)防，這個問題有待進(jìn)一步研究解決。