人臍帶干細(xì)胞治療重度燒傷大鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張怡，林冰，陳劍鋒

（1.大連市口腔醫(yī)院正畸科，遼寧 大連 116021； 2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，遼寧 大連 116011）

據(jù)文獻(xiàn)［1-2］報(bào)道，大面積重度燒傷患者在傷后數(shù)小時(shí)即出現(xiàn)了黃疸、轉(zhuǎn)氨酶升高等肝損害表現(xiàn)，嚴(yán)重者還可誘發(fā)急性肝功能衰竭、甚至是多器官功能衰竭，影響燒傷患者的存活和預(yù)后。因此，在大面積重度燒傷后早期積極救治患者的同時(shí)，注意保護(hù)肝功能也是非常關(guān)鍵的。近年來(lái)，有關(guān)人臍帶干細(xì)胞移植治療肝損傷以及嚴(yán)重性肝臟疾病的研究［3-5］已經(jīng)大量涌現(xiàn)。王福生團(tuán)隊(duì)的系列研究［6-7］顯示，人臍帶干細(xì)胞的輸注可有效逆轉(zhuǎn)小鼠爆發(fā)性的肝功能衰竭并顯著改善終末期肝病患者的肝功能，且證實(shí)該干細(xì)胞的臨床應(yīng)用安全有效，可作為乙型肝炎病毒相關(guān)失代償肝硬化患者新型的治療方案。此外，XUE 等［8］通過(guò)體內(nèi)外的研究證實(shí)，人臍帶干細(xì)胞在進(jìn)行肝損傷的微環(huán)境中，可通過(guò)分化為肝細(xì)胞而修復(fù)重建損傷的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。但多數(shù)新近的研究［9-10］認(rèn)為，移植的干細(xì)胞在急性損傷的修復(fù)過(guò)程中，是通過(guò)旁分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子調(diào)控局部組織微環(huán)境，從而發(fā)揮修復(fù)損傷組織器官的功能。因此，本研究擬在這些前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究人臍帶干細(xì)胞的移植對(duì)大面積重度燒傷大鼠早期急性肝損傷的治療作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)雄性SD大鼠30 只，體質(zhì)量 （200±15） g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物購(gòu)進(jìn)后在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周以上，室溫維持在22～25 ℃。

1.1.2 儀器與試劑：電熱恒溫水浴鍋 （中國(guó)金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠） ，戊巴比妥鈉 （美國(guó)Sigma公司） ，乳酸鈉林格氏液 （石家莊四藥有限公司） ，碘伏消毒液 （北京四環(huán)衛(wèi)生藥械廠） ，75 %醫(yī)用乙醇 （北京市遠(yuǎn)弘藥用酒精廠）；人臍帶干細(xì)胞和培養(yǎng)基 （美國(guó)Sciencell 公司） ，胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、青霉素-鏈霉素雙抗 （中國(guó)碧云天生物科技研究所）；小鼠抗人的CD105抗體的單克隆抗體 （美國(guó)LSBio公司） ，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （瑞士ROCHE公司） ，促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α） 、白介素1β （interleukin 1β， IL-1β） 和白介素6 （interleukin 6，IL-6） 的ELISA檢測(cè)試劑盒 （美國(guó)eBioscience公司），CO2培養(yǎng)箱 （美國(guó)Thermo公司） ，倒置熒光顯微鏡 （德國(guó)Leica公司） ，血生化自動(dòng)分析儀 （美國(guó)Beckman公司） 。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶干細(xì)胞的準(zhǔn)備：將前期購(gòu)置且凍存的人臍帶干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，使用第4～5 代的人臍帶干細(xì)胞進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組：將適應(yīng)性飼養(yǎng)的大鼠隨機(jī)分為假傷組、燒傷組和干細(xì)胞組。實(shí)驗(yàn)致傷前12 h大鼠禁食水，1% 戊巴比妥鈉 （40 mg/kg） 腹腔內(nèi)注射麻醉，背、頸、頭部電推剃毛后，使用脫毛劑進(jìn)行脫毛，98 ℃處理，10 s造成大鼠頭、頸、背部 35%總體表面積 （total body surface area，TBSA） Ⅲ度燙傷（經(jīng)病理切片證實(shí)，以下均稱(chēng)燒傷） 。假傷組大鼠則使用37 ℃處理10 s。傷后3 組大鼠均行腹腔注射乳酸鈉林格氏液 （40 mg/kg） 抗休克治療。燙傷部位使用1 %碘伏處理，2 次/d，保持創(chuàng)面干燥，防止感染。此外，傷后干細(xì)胞組即刻給予干細(xì)胞5×106/mL PBS經(jīng)大鼠尾靜脈移植；燒傷組和假傷組則經(jīng)尾靜脈移植注射1 mL PBS。

1.2.3 標(biāo)本采集：于干細(xì)胞移植后24 h，采用1 %戊巴比妥鈉 （40 mg/kg） 腹腔內(nèi)注射麻醉各組大鼠，抽取腹主動(dòng)脈血液10 mL，室溫靜置15 min后，3 000 r/min離心20 min，收集血清行肝功能指標(biāo)的檢測(cè)分析。采血后，收集各組大鼠的肝組織，4%多聚甲醛固定，待檢測(cè)。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)：

1.2.4.1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)人臍帶干細(xì)胞在肝組織中的分布情況 4%多聚甲醛固定腎組織1周后，制備組織切片。按照組織化學(xué)染色步驟進(jìn)行染色，各組切片分別滴加100 μL小鼠抗人CD105的單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，DAB顯色和蘇木素復(fù)染封片。使用正置顯微鏡觀察并拍照記錄CD105+表達(dá)的細(xì)胞，即人臍帶干細(xì)胞 （CD105是人臍帶干細(xì)胞重要的表面標(biāo)志物） 在肝組織中的分布情況。

1.2.4.2 ELISA法檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平 將采集的各組大鼠肝組織標(biāo)本，在4 ℃下進(jìn)行組織勻漿，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明測(cè)定勻漿上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.2.4.3 TUNEL染色檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡情況 方法同1.2.4.1制備和染色切片，但各組切片按照TUNEL試劑盒的染色步驟進(jìn)行染色，中性樹(shù)膠封片。使用正置顯微鏡觀察并拍照記錄各組肝細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.4.4 HE染色檢測(cè)腎組織的病理學(xué)變化 方法同1.2.4.1制備切片，但各組切片按照HE的染色步驟進(jìn)行染色，中性樹(shù)膠封片。使用正置顯微鏡觀察并拍照記錄各組肝組織的病理學(xué)改變情況。

1.2.4.5 血生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)腎功能學(xué)指標(biāo) 使用血生化自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析各組大鼠血清標(biāo)本，各組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （alanine transaminase，ALT） 、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （aspartate aminotransferase，AST）以及乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LHD） 的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量數(shù)據(jù)，以x-±s表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人臍帶干細(xì)胞在大面積重度燒傷大鼠肝臟組織中的分布情況

免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示，假傷組和燒傷組大鼠的肝臟組織中未見(jiàn)到CD105陽(yáng)性染色的細(xì)胞（也即人臍帶干細(xì)胞） ，但干細(xì)胞組中則有較多人臍帶干細(xì)胞分布在肝臟組織中，且集中分布在肝組織的小血管內(nèi)，見(jiàn)圖1。

2.2 人臍帶干細(xì)胞對(duì)大面積重度燒傷大鼠肝臟組織促炎癥細(xì)胞因子的影響

燒傷組中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均較假傷組顯著升高，但干細(xì)胞組中這些促炎因子的水平則較燒傷組顯著下降，仍高于假傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，見(jiàn)表1。

圖1 3組大鼠肝臟組織中人臍帶干細(xì)胞的分布情況 ×400Fig.1 The distribution patterns of human umbilical cord stem cells in hepatic tissue from the three groups of rats ×400

2.3 人臍帶干細(xì)胞對(duì)大面積重度燒傷大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色的結(jié)果顯示，假傷組僅有少量陽(yáng)性染色的凋亡細(xì)胞，燒傷組中凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著高于假傷組，而干細(xì)胞組中凋亡細(xì)胞的數(shù)量則顯著低于燒傷組，見(jiàn)圖2。

表1 人臍帶干細(xì)胞對(duì)肝臟組織促炎癥細(xì)胞因子的影響Tab.1 The effect of human umbilical cord stem cells on the levels of proinflammatory factors in liver tissues

表1 人臍帶干細(xì)胞對(duì)肝臟組織促炎癥細(xì)胞因子的影響Tab.1 The effect of human umbilical cord stem cells on the levels of proinflammatory factors in liver tissues

Compared with sham group，1） P ＜ 0.05；compared with burn group，2） P ＜ 0.05.

GroupTNF-α（pg/mL）IL-1β （pg/mL）IL-6（pg/mL）Sham 993.17±64.92 218.19±73.92 711.51±89.91 Burn 4 813.24±371.991） 1 053.49±45.591） 3 461.26±248.221）Stem cells 2 596.53±232.081），2） 699.15±65.591），2） 2 415.24±309.131），2）

2.4 人臍帶干細(xì)胞對(duì)大面積重度燒傷大鼠肝臟組織病理學(xué)改變的影響

HE染色檢測(cè)3組大鼠肝組織的病理學(xué)改變，假傷組肝細(xì)胞呈正常結(jié)構(gòu)，肝索排列整齊，肝竇無(wú)狹窄。但燒傷組肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞濁腫、胞質(zhì)疏松、脂肪變性，部分肝板結(jié)構(gòu)及血竇消失，散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)小灶性聚集。而干細(xì)胞組大鼠肝組織的病理學(xué)改變則較燒傷組顯著減輕。見(jiàn)圖3。

2.5 人臍帶干細(xì)胞對(duì)大面積重度燒傷大鼠肝功能的影響

與假傷組相比，燒傷組中AST、ALT以及LDH水平顯著升高，而干細(xì)胞中這些指標(biāo)的水平則較燒傷組顯著下降，但仍高于假傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05） ，見(jiàn)表2。

圖2 3組大鼠肝細(xì)胞的凋亡情況 ×400Fig.2 The apoptosis of the liver cells in the three groups of rats ×400

圖3 3組大鼠的肝組織的病理學(xué)變化 ×400Fig.3 The pathologic changes in the liver tissue in the three groups of rats ×400

3 討論

如前所述，大面積重度燒傷后早期即可出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷并呈進(jìn)行性加重，因此對(duì)這類(lèi)重度燒傷患者早期積極救治的同時(shí)進(jìn)行肝組織結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)是十分有意義的。大量的文獻(xiàn)［11-13］顯示，干細(xì)胞可通過(guò)多重機(jī)制對(duì)肝臟損傷以及肝纖維化等肝臟疾病進(jìn)行有效的修復(fù)和治療，但相關(guān)的機(jī)制仍不十分明確。本研究結(jié)果顯示，人臍帶干細(xì)胞遷移定植于肝組織，可以有效降低局部組織促炎因子水平和肝細(xì)胞凋亡數(shù)量，改善和保護(hù)肝組織的結(jié)構(gòu)和功能，從而為干細(xì)胞移植治療急性肝損傷患者提供理論依據(jù)。

表2 人臍帶干細(xì)胞對(duì)肝功能指標(biāo)的影響 Tab.2 The effect of human umbilical cord stem cells on parameters of liver function （

表2 人臍帶干細(xì)胞對(duì)肝功能指標(biāo)的影響 Tab.2 The effect of human umbilical cord stem cells on parameters of liver function （

1） compared with sham group， P ＜ 0.05；2） compared with burn group，P ＜ 0.05.

GroupAST （U/L）ALT （U/L）LDH （U/L）Sham 115.26±28.36 51.22±8.84 1 009.63±150.42 Burn 527.19±29.371） 172.43±23.901） 2 253.14±142.351）Stem cells 299.31±15.581），2） 89.31±15.251），2） 1 628.29±25.01），2）

本研究結(jié)果顯示，大面積重度燒傷大鼠受損肝臟組織局部的TNF-α、IL-1β和IL-6等主要的促炎癥細(xì)胞因子水平均顯著增高，由于這些促炎癥細(xì)胞因子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，因此在介導(dǎo)大面積重度燒傷后急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用；而移植的人臍帶干細(xì)胞遷移定植于受損的肝組織后，可通過(guò)顯著降低肝臟組織的促炎癥細(xì)胞因子水平發(fā)揮顯著減輕肝細(xì)胞凋亡的作用。在干細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)治療損傷和疾病的過(guò)程中，有關(guān)干細(xì)胞遷移歸巢的機(jī)制，GIORDANO等［14］和KHATUN等［15］的研究均認(rèn)為與損傷組織局部上調(diào)表達(dá)的一些細(xì)胞因子/趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白1等密切相關(guān)，干細(xì)胞被誘導(dǎo)趨化入局部的損傷組織，發(fā)揮了有效保護(hù)、修復(fù)和治療的作用。而有關(guān)干細(xì)胞通過(guò)減輕炎癥發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，一些研究［16-17］則認(rèn)為，干細(xì)胞是通過(guò)強(qiáng)大的旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)了重要臟器組織中炎癥細(xì)胞的活性、抑制促炎癥細(xì)胞因子的合成釋放、增加抗炎癥細(xì)胞因子的含量等，改善和調(diào)控局部組織的炎癥微環(huán)境，進(jìn)而減輕局部組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷。

此外，本研究結(jié)果顯示，大面積重度燒傷后早期肝臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化也是加重肝功能障礙的原因之一，而人臍帶干細(xì)胞的移植可顯著減輕此重度燒傷誘導(dǎo)肝組織的病理學(xué)改變，進(jìn)而保護(hù)和治療肝功能。這與JIN等［18］的研究結(jié)果比較相似，即將骨髓干細(xì)胞移植入化學(xué)性肝損傷小鼠的體內(nèi)，顯著減輕了肝組織的病理學(xué)改變，進(jìn)而顯著改善了損傷的肝功能，提高了小鼠的存活率。