miR-194對人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

滕浩，薛一雪，王萍，劉云會

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122）

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，按病理分級可分為Ⅰ～Ⅳ 4個級別。Ⅳ級膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM） ，是顱內(nèi)致死率最高的腫瘤之一，生長呈浸潤性，血運豐富，邊界不清。目前GBM的主要治療手段為手術(shù)切除，術(shù)后同步進行放、化療。但由于腫瘤高度的侵襲性及增殖能力，預(yù)后往往不佳［1］，患者平均生存期也僅有14個月［2］，5年生存率僅5%［3］。研究GBM相關(guān)的分子標(biāo)志物有可能為GBM的診斷、治療及預(yù)后評估提供新的策略。

微小RNA （microRNA，miRNA） 通過與靶基因的3’端非編碼區(qū)域相結(jié)合，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究顯示，miR-194在喉癌［4］、腎透明細(xì)胞癌［5］、胃癌［6］、非小細(xì)胞肺癌［7］等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，但在膠質(zhì)瘤中的作用尚未見報道。本研究旨在探討miR-194在不同級別的膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，以及對U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲影響，以期為膠質(zhì)瘤的診斷及治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 膠質(zhì)瘤組織

23例人腦膠質(zhì)瘤組織均取于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，Ⅰ～Ⅱ級7例，Ⅲ～Ⅳ級16例，用于陰性對照的腦組織共5例，來源于腦出血、外傷組織。所有組織離體后立即放入液氮中保存。取材前所有患者均已簽署知情同意書，并經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及材料

Trizol試劑 （美國Invitrogen公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基 （美國Corning公司）；胎牛血清 （天津灝洋生物科技有限公司）；DMSO （美國Sigma公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000和Opti-MEM?Ⅰ （美國Invitrogen 公司）；TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit （美國Ambion公司）；TaqMan? Universal Master Mix II （美國Ambion公司）；miR-194激動劑miR-194 agomir、拮抗劑miR-194 antagomir （蘇州吉瑪公司）；CCK-8 Kit（上海東仁化學(xué)科技公司）；基質(zhì)膠Matrigel （美國BD Biosciences 公司）；吉姆薩染液 （北京雷根生物公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒 （上海東仁化學(xué)科技公司） 。

1.3 方法

1.3.1 組織總RNA提取與實時熒光定量PCR：膠質(zhì)瘤組織4 ℃預(yù)冷的PBS清洗后加入1 mL Trizol試劑，吹打數(shù)次后移入1.5 mL EP管中，靜置5 min后加入0.2 mL氯仿，手動劇烈震蕩，室溫下靜置3 min。將樣品放入4 ℃ 離心機中，12 000 g離心15 min，取上層水相至新的EP管中，向樣品中加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫下靜置10 min。4 ℃ 12 000 g離心15 min，棄上清，向樣品中加入1 mL 75%乙醇。4 ℃ 7 500 g離心5 min，細(xì)胞間干燥10～15 min后加入30～40 μL DEPC水。獲取的RNA應(yīng)用TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription Kit及TaqMan? Universal Master MixⅡ 試劑盒及7500 Fast Real time PCR系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR。以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.2 U87細(xì)胞培養(yǎng)：U87細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM高塘培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，傳代次日更換培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.3.3 miR-194瞬時轉(zhuǎn)染與分組：使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000和Opti-MEM?I 將miR-194 激動劑、拮抗劑及陰性對照轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中，并檢測轉(zhuǎn)染效率。實驗分為5組：空白對照組 （Control） 、轉(zhuǎn)染miR-194 agomir陰性對照組 （pre-NC） 、轉(zhuǎn)染miR-194 agomir實驗組 （pre-miR-194） 、轉(zhuǎn)染miR-194 antagomir陰性對照組 （anti-NC） 和轉(zhuǎn)染miR-194 antagomir實驗組（anti-miR-194） 。

1.3.4 CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力：U87細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中，每孔大約2 000個細(xì)胞，每組細(xì)胞鋪5個副孔。在37 ℃細(xì)胞孵箱中分別培養(yǎng)48 h，加入Cell Counting Kit-8 10 μL后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中1 h。將96孔板放入酶標(biāo)儀，選取波長450 nm，測定每孔的光密度（OD）值。

1.3.5 細(xì)胞遷移實驗：向24孔板內(nèi)每孔加入600 μL含有10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，孔內(nèi)放置孔徑為8 μm的Transwell小室。待處理細(xì)胞用PBS清洗2次，消化。棄去消化液后加入適量無血清培養(yǎng)液，并吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后取100 μL細(xì)胞懸液 （約含10 000個細(xì)胞） 均勻地鋪在Transwell上室內(nèi)，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后取出小室，用棉棒將上室內(nèi)面沒有遷移過去的細(xì)胞擦凈，放入提前配制的固定液中 （甲醇∶冰乙酸 = 3∶1） 固定30 min。用PBS清洗小室后晾干。配制吉姆薩染液（染液∶工作液=1∶9)。將小室倒置，吉姆薩染液滴于小室底面染色1 h。用PBS清洗2次，在倒置顯微鏡（400×） 下觀察細(xì)胞的遷移情況，每組隨機5個視野，統(tǒng)計細(xì)胞個數(shù)，以此代表細(xì)胞的遷移能力。

1.3.6 細(xì)胞侵襲實驗：Matrigel基質(zhì)膠提前融化。取50 μL基質(zhì)膠（500 ng/μL）均勻地鋪在小室內(nèi)面，放入37 ℃恒溫箱中4 h，使基質(zhì)膠凝固。后續(xù)實驗方法及統(tǒng)計方法同遷移實驗。

1.3.7 細(xì)胞凋亡實驗：應(yīng)用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞輕輕吹打成懸液后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心3 min收集細(xì)胞。用PBS繼續(xù)清洗，1 000 r/min離心3 min，離心后倒掉上清。重復(fù)2次。每管加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞。每管相繼加入5 μL PI和5 μL FITC混勻，室溫避光15 min。上機前吹打均勻細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR檢測miR-194在膠質(zhì)瘤組織

及細(xì)胞中表達(dá)

與對照組腦組織比較，miR-194在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量顯著降低，并且表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤組織級別的升高而減少 （P ＜ 0.05，圖1A） 。與正常人腦星型膠質(zhì)細(xì)胞比較，miR-194在人腦U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)量也顯著減少 （P ＜ 0.01，圖1B） 。

2.2 miR-194轉(zhuǎn)染效率的檢測

圖1 miR-194在膠質(zhì)瘤組織及U87細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 mRNA expression of miR-194 in glioma tissues and glioma U87 cells

與對照組比較，pre-NC組及anti-NC組miR-194的表達(dá)水平未見明顯變化。與pre-NC組比較，pre-miR-194組miR-194的表達(dá)水平顯著上調(diào) （P ＜ 0.01） ，與anti-NC組比較，anti-miR-194組miR-194的表達(dá)水平顯著下降 （P ＜ 0.01，圖2A） 。

2.3 miR-194對U87細(xì)胞增殖能力的影響

與對照組比較，pre-NC組及anti-NC組細(xì)胞增殖能力未見明顯變化。與pre-NC組比較，pre-miR-194組細(xì)胞增殖能力明顯下降 （P ＜ 0.01） ，而與anti-NC組比較，anti-miR-194組細(xì)胞增殖能力顯著增加 （P ＜0.01） 。結(jié)果表明miR-194能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力 （圖2B） 。

2.4 miR-194對U87細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

與對照組比較，pre-NC組及anti-NC組細(xì)胞遷移及侵襲能力未見明顯變化。與pre-NC組比較，premiR-194組細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯下降 （P ＜ 0.01） ，而與anti-NC組比較，anti-miR-194組細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著增加 （P ＜ 0.01） 。結(jié)果表明miR-194能夠抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力 （圖2C） 。

2.5 miR-194對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，pre-NC組及anti-NC組細(xì)胞凋亡情況未見明顯變化。與pre-NC組比較，pre-miR-194組細(xì)胞凋亡率明顯增加 （P ＜ 0.01） ，而與anti-NC組比較，anti-miR-194組細(xì)胞凋亡率顯著下降 （P ＜ 0.01） 。結(jié)果顯示miR-194能夠促進U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡（圖2D） 。

3 討論

GBM由于其侵襲性生長的特點手術(shù)往往難以完整切除，腫瘤極易殘余、復(fù)發(fā)。術(shù)后常規(guī)行放、化療雖能一定程度上延緩疾病的進展，但血腦屏障、血腫瘤屏障的存在限制了治療效果，患者仍然難以獲得滿意預(yù)后［8］。近來大量研究［9-10］顯示，基因的異常表達(dá)以及基因間異常調(diào)控作用與膠質(zhì)瘤的形成、發(fā)展密切相關(guān)。

圖2 miR-194的轉(zhuǎn)染效率以及對U87細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.2 Transfection efficiency of miR-194 and the effect of miR-194 on the proliferation，migration，invasion，and apoptosis of U87 cells

miRNA是一類長度18～25個核苷酸的非編碼RNA，具有高度保守性，不具備開放閱讀框架，通過與靶基因的3’UTR區(qū)域相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制或降解靶基因表達(dá)，從而抑制蛋白合成。miRNA在胚胎形成、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、腫瘤的形成等諸多方面發(fā)揮著多元化的調(diào)控作用。miR-194是miRNA的成員之一，在大部分腫瘤的生長、分化、遷移、侵襲及凋亡過程中起抑癌作用。在骨肉瘤中，離體及在體實驗［11］均證明miR-194能夠通過靶向作用于CDH2和IGF1R來抑制細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌中，miR-194能夠通過調(diào)控MAP4K4/c-Jun/MDM2信號途徑抑制細(xì)胞的增殖能力［12］。在膀胱癌中，miR-194通過抑制RAP2B的表達(dá)進而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力［13］。然而，也有報道m(xù)iR-194在前列腺癌、卵巢癌、胰腺導(dǎo)管腺癌中分別通過作用于SOCS2［14］、PTPN12［15］以及DACH1［16］來促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖、克隆形成、遷移及侵襲作用。這可能是基因在不同組織中的差異性作用所致。

本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR分析，證實了miR-194在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)量明顯低于對照腦組織，且表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤級別升高而降低。將miR-194轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞后，應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-194后U87細(xì)胞增殖能力顯著下降，而沉默miR-194后細(xì)胞增殖能力顯著增加。遷移、侵襲實驗顯示，miR-194過表達(dá)后細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著下降，沉默miR-194后細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯增加。凋亡實驗顯示，過表達(dá)miR-194后細(xì)胞的凋亡率顯著增加，而沉默miR-194后細(xì)胞凋亡率顯著減少。上述研究結(jié)果表明miR-194在膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中發(fā)揮抑癌的作用，可以作為膠質(zhì)瘤治療的靶點之一。

然而，膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展機制極其復(fù)雜，miR-194是通過何種機制、哪些靶基因發(fā)揮的抑癌作用有待于今后進一步研究。