急性HIV感染者γδ T細胞及其細胞亞群的表型分析①

吳 江 王 蕊 畫 偉 王桂芳 李群輝 李 珍

(中國疾病預(yù)防控制中心科技開發(fā)辦公室，北京 100050)

γδ T細胞是一種天然免疫細胞，主要分為Vδ1和Vδ2 T細胞兩種亞群，在抗HIV感染中發(fā)揮重要作用[1]。HIV感染導(dǎo)致機體免疫細胞高度活化，T、B淋巴細胞等免疫細胞表面活化、增殖、凋亡分子的表達增加[2]。慢性免疫活化可以引起免疫耗竭，抑制性分子的表達增加[3,4]。HIV通過調(diào)節(jié)PD-1等抑制性分子的表達而形成免疫逃逸，使HIV持續(xù)存在[5,6]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，急性HIV感染者γδ T細胞表面活化分子的表達顯著增加[7,8]，但其抑制和凋亡分子的表達情況還不完全清楚。因此，本研究對急性HIV感染者γδ T細胞活化、抑制、凋亡等表型進行分析，以詮釋γδ T細胞在急性HIV感染中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選取2015年1月至2016年12月期間，北京佑安醫(yī)院在男男同性戀人群(Men who have sex with men,MSM)中篩查出的HIV急性期感染者15例。根據(jù)Fiebig分期，將急性HIV感染(AHI)分為6個階段[9,10]，F(xiàn)iebig Ⅰ-Ⅱ(HIV RNA+，HIV Ab-)：1例；Fiebig Ⅲ-Ⅳ(HIV RNA+，HIV Ab+，WB-/±)：2例；Fiebig Ⅴ-Ⅵ(HIV RNA+，HIV Ab+，WB+，缺少p31條帶)：12例。采集患者抗凝血和血漿，用于淋巴細胞數(shù)量和病毒載量檢測。8例HIV陰性者為健康對照組。研究對象的詳細資料見表1。所有參與者均簽訂知情同意書，本研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會的審查。

1.1.2流式抗體 PE標記的抗人Vδ2TCR mAb(IMMU389)(Beckman Coulter公司，美國)；FITC標記的抗人Vδ1TCR mAb(TS8.2)(Pierce公司，美國)；APC標記的抗人γδTCR mAb(B1)、Percp-cy5.5標記的抗人CD38 mAb(HIT2)、PE-cy7標記的抗人CD160 mAb(BY55)、APC-cy7標記的抗人PD-1 mAb(EH12.2H7)、APC-cy7標記的抗人CD95 mAb(DX2)、APC標記的抗人CD262(DR5，TRAIL-R2)mAb[DJR2-4(7-8)]和對應(yīng)的同型抗體(Biolegend公司，美國)。

1.1.3其他材料 淋巴細胞分離液(天津灝洋生物有限公司，中國)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司，美國)；牛血清白蛋白(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，中國)；FACSCalibur TruCount 計數(shù)管、CantoⅡ流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.2方法

1.2.1T淋巴細胞計數(shù) 采用FACSCalibur TruCount 計數(shù)管和多色標記抗體(CD3/CD4/CD8/CD45)標記細胞，流式細胞儀檢測分析CD3+、CD4+和CD8+T細胞的百分比和絕對計數(shù)。

1.2.2病毒載量檢測 血漿病毒載量采用雅培Real-time HIV-1 M2000系統(tǒng)檢測，最低檢測線為40拷貝/ml。

1.2.3流式細胞術(shù) 取新鮮分離的外周血單個核細胞(PBMCs)，洗滌后加入不同熒光標記的抗人TCRγδ、Vδ1TCR、Vδ2TCR、CD38、PD-1、CD160、CD95和CD262 mAbs，同時設(shè)置單陽對照和同型對照，室溫避光孵育20 min。洗滌后，加入300 μl 2%多聚甲醛固定液。流式細胞儀采集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1病例分析 急性HIV感染者平均年齡為(29.4±6.9)歲，平均感染時間為(72.4±40.6)d。健康對照組平均年齡為(30.3±6.3)歲，兩組年齡的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

2.2急性HIV感染者γδ T細胞及其細胞亞群頻率的變化 與健康對照組相比較，急性HIV感染者(AHI)γδ T細胞的比例無顯著變化。Vδ1 T細胞的比例較健康對照組顯著增加(P=0.031)，而Vδ2 T細胞的比例則顯著下降(P=0.033)，見圖1。

2.3急性HIV感染者γδ T細胞的活化水平顯著增加 與健康對照組相比較，急性HIV感染者CD38+γδ T細胞、CD38+Vδ1 T細胞和CD38+Vδ2 T細胞比例顯著增加(P=0.002、P=0.000 6、P=0.004)。此外，在急性HIV感染者中，CD38+Vδ1T細胞的比例顯著高于CD38+Vδ2T細胞(P<0.000 1)，而在健康對照組中，CD38+Vδ1T細胞與CD38+Vδ2T細胞比例的差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.279)，見圖2。

2.4急性HIV感染者γδ T細胞表面抑制性分子的表達 與健康對照組相比較，急性HIV感染者PD-1+γδ T細胞的比例顯著增加(P=0.032)，而PD-1+Vδ1 T細胞和PD-1+Vδ2 T細胞的比例無顯著差異(P=0.06、P=0.949)。此外，在健康對照組和急性HIV感染者中，PD-1+Vδ1 細胞的比例均顯著高于PD-1+Vδ2 細胞的比例(P=0.028，P=0.000 1),見圖3A。而急性HIV感染者CD160+γδ T細胞、CD160+Vδ1 T細胞和CD160+Vδ2 T細胞的比例與健康對照組相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。但在急性HIV感染者中，CD160+Vδ1 T細胞的比例顯著高于CD160+Vδ2T細胞(P=0.009)，見圖3B。

表1健康對照組和急性HIV感染者的基本資料

Tab.1Basiccharacteristicsofhealthycontrols(HCs)andacuteHIV-infectedpatients

GroupnAge(y)Infectiontime(d)CD3+Tcell(cells/μl)CD4+Tcell(cells/μl)CD8+Tcell(cells/μl)CD4/CD8HIV RNALog10copies/mlHCs829.4±6.9NANANANANANAAHI1530.3±6.372.4±40.61 530±541398±1431 057±4440.456±0.2564.45±1.11

Note：NA.Not applied.

圖1 健康對照組(n=8)和急性HIV 感染者(n=15)γδ T細胞及其亞群分布的比較Fig.1 Comparisons of frequencies of γδ T cell and their subsets between healthy controls(n=8) and acute HIV-infected patients(n=15)Note:Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

圖2 健康對照組(n=8)和急性HIV感染者(n=15)γδ T細胞及其亞群活化水平的比較Fig.2 Comparisons of activation of γδ T cell and their subsets between healthy controls(n=8) and acute HIV-infected patients(n=15)Note:Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

圖3 健康對照組(n=8)和急性HIV感染者(n=15)γδ T細胞及其亞群抑制性分子的表達Fig.3 Expression of inhibitors on γδ T cell and their subsets from both healthy controls(n=8) and acute HIV-infected patients(n=15)Note:A.PD-1；B.CD160.Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

圖4 健康對照組(n=8)和急性HIV感染者(n=15)γδ T細胞及其亞群凋亡分子的表達Fig.4 Expression of apoptosis markers on γδ T cell and their subsets from both healthy controls(n=8) nd acute HIV-infected patients(n=15)Note:A.CD95；B.TRAIL-DR5.Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

2.5急性期HIV感染者γδ T細胞表面凋亡分子的表達 與健康對照組相比較，急性HIV感染者CD95+γδ T細胞、CD95+Vδ1 T細胞和CD95+Vδ2 T細胞的比例增加，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。此外，急性HIV感染者DR5+γδ T細胞的比例較健康對照組顯著增加(P=0.048)，而DR5+Vδ1 T細胞和DR5+Vδ2 T細胞的比例與健康對照組相比，差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。但在急性HIV感染者中，CD95+Vδ1T細胞和DR5+Vδ1T細胞的比例均顯著高于CD95+Vδ2T細胞和DR5+Vδ2T細胞的比例(P=0.001，P=0.027)，見圖4。

3 討論

慢性免疫活化、CD4+T細胞的減少是HIV感染及疾病進展的主要特征[11,12]。急性HIV感染者γδ T細胞、Vδ1和Vδ2 T細胞高度活化，且Vδ2 T細胞比例較健康對照組顯著減少。慢性病毒感染中，免疫活化可以導(dǎo)致機體免疫細胞耗竭，抑制分子的表達增加，并與T細胞功能缺陷相關(guān)[3,5,13]。然而，急性HIV感染中γδ T細胞抑制性分子的表達還不清楚。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，急性HIV感染者PD-1+γδ T細胞的比例顯著增加，而CD160+γδ T細胞的比例無顯著變化。研究報道，共刺激分子的表達與細胞的分化狀態(tài)相關(guān)，CD160、PD-1主要表達在記憶性CD4+或CD8+T細胞上[14,15]。本研究尚未對γδ T細胞、Vδ1和Vδ2 T細胞的分化狀態(tài)進行分析，因此未在急性HIV感染者和健康對照組中發(fā)現(xiàn)γδ T細胞及其亞群CD160、PD-1表達的差異。此外，T細胞活化或增殖后，CD160的表達并不上調(diào)[15]，這也可以解釋本研究中急性HIV感染者γδ T細胞表面CD160表達不上調(diào)的原因。研究結(jié)果顯示，PD-1+記憶性CD4+T細胞比例增加與HIV感染兒童CD4+T細胞增殖能力降低和炎癥性細胞因子分泌增加相關(guān)[4]。CD160的表達可單獨影響CD8+T細胞增殖、穿孔素的表達和細胞因子分泌，而不依賴PD-1的表達[15]。正常情況下，Vδ2 T細胞幾乎不表達PD-1，而一旦被激活后，PD-1表達大量增加。PD-1/PD-L1的相互作用通過下調(diào)IFN-γ的產(chǎn)生和細胞毒活性而降低Vδ2 T細胞的抗腫瘤活性[16]。但PD-1、CD160等抑制性分子如何調(diào)節(jié)HIV感染者γδ T細胞及其亞群的功能還需進一步研究。

HIV感染者pDC產(chǎn)生大量的IFN-α，促進TRAIL、DR5、Fas和FasL的表達，進而引起CD4+T細胞凋亡[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，急性HIV感染者γδ T細胞表面CD95(Fas)的表達無顯著變化，而TRAIL-DR5的表達顯著增加，這可能與急性HIV感染者血漿中存在高水平的IFN-α有關(guān)[20]。前期研究發(fā)現(xiàn)，AIDS患者γδ T細胞可殺傷自體HIV感染的CD4+T細胞[21]。因此推測，通過TRAIL/TRAIL受體途徑，而不是Fas/FaL途徑，誘導(dǎo)HIV感染CD4+T細胞凋亡是γδ T細胞殺傷HIV感染的CD4+T細胞的機制之一。此外，本研究顯示，急性HIV感染者Vδ2 T細胞的數(shù)量減少，活化增加。然而，阻斷Fas并不能阻止包膜蛋白誘導(dǎo)的細胞死亡，且gp120也不能改變Vδ2 T細胞Fas和FasL的表達[22]。因此，HIV感染者Vδ2 T細胞數(shù)量減少的主要原因并不是活化誘導(dǎo)的細胞凋亡，可能是由于HIV直接感染或HIVgp120與Vδ2 T細胞表面CCR5結(jié)合導(dǎo)致的[1,22,23]。

本研究首次在急性HIV感染者中發(fā)現(xiàn)Vδ1 T細胞活化、抑制和凋亡分子的表達均顯著高于Vδ2 T細胞，表明Vδ1 T細胞在HIV感染及疾病進展中起引更為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染疾病快速進展者中，Vδ1T細胞的比例顯著增高[7]，并可殺傷HIV感染的CD4+T細胞或旁路CD4+T細胞，引起HIV感染者CD4+T細胞減少，進而加速疾病進展[24,25]。但目前對于Vδ1 T細胞的研究相對較少，且本研究采用的樣本量較少，需要在大樣本中對結(jié)果進行驗證，并深入研究Vδ1 T細胞在HIV感染及疾病進展中的機制。

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