黃芩素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞PTEN、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)的影響

宋紅群 王寧 李超彥

結(jié)腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界范圍內(nèi)許多國家惡性腫瘤高死亡率的原因之一[1]，在發(fā)達(dá)國家每年影響人數(shù)超過100萬人[2]，嚴(yán)重威脅著人類健康。在我國惡性腫瘤患者中，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率均較高，發(fā)病率居惡性腫瘤發(fā)病率的第三位，僅次于肺癌和胃癌，死亡率居第五位[3]。結(jié)腸癌易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，故其病死率較高，預(yù)后較差。盡管隨著治療手段的不斷改進(jìn)，結(jié)直腸癌的治療效果得到明顯改善，但在2008年的統(tǒng)計(jì)中，其病死率仍達(dá)8.8%。結(jié)腸癌的腫瘤發(fā)生及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是多因素參與的復(fù)雜過程，除腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的改變外，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、生長及凋亡的相關(guān)癌基因和抑癌基因表達(dá)異常在其發(fā)生過程中起著非常重要的作用[4-6]。

黃芩素屬黃酮類物質(zhì)，主要來源于黃芩的根部。黃芩素具有明顯的抗炎活性，且與NF-kappaB的激活關(guān)系密切[7]。有研究表明，黃芩素能在人卵巢癌等腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用[8-10]。我們的前期研究顯示，黃芩素能夠影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增生及凋亡，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究以人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620為對(duì)象，觀察不同濃度黃芩素對(duì)其細(xì)胞生長及腫瘤抑制基因PTEN(phosphatase and tensin homologue，PTEN)和Akt蛋白表達(dá)的影響，探討黃芩素的抗腫瘤作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 黃芩素，分子量270.24，黃色粉末，規(guī)格100 mg，購自sigma公司(465119)，純度≥98%，易溶于乙醇、甲醇。取黃芩素粉末10 mg，溶于甲醇中，制備成200 μmol/L的溶液備用。使用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度加入培養(yǎng)細(xì)胞中。

1.2 細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620為51歲白人來源的結(jié)腸腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，購置于上海生物研究所。

1.3 其他材料 試劑低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司(11885092，10099-141)，MTT購自sigma公司(M2128)；EdU檢測試劑盒購自Invitrogen公司(C10646)；蛋白提取試劑盒購自Calbiochem公司(539790)；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司(11885092)；Transwell小室購自美國BD公司(353093)；兔抗人多克隆PTEN、Akt及p-Akt S473抗 體 購 自 ABCam公 司 (ab32199，ab126811，ab66138)；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司(ZB-5301)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的SW620細(xì)胞，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并放置在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)環(huán)境中。

1.4.2 EdU染色和MTT法測定細(xì)胞增生抑制率SW620細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，消化并制作成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×104/mL，以100 μL/孔接種于96孔板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h。分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為0、25、50、75 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，48 h，每空加入100 μL含有濃度為50 μmol/L的EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次。每孔加入50 μL含4%多聚甲醛的固定液進(jìn)行固定，室溫放置30 min。按照EdU檢測試劑盒的說明書進(jìn)行EdU染色。隨后用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染。熒光顯微鏡下觀察并記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

收集對(duì)數(shù)生長期的SW620細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104/mL的細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h。分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為0、25、50、75 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)12 h，24 h，36 h，48 h后，每孔加濃度為5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4 h后終止后，振蕩15 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度OD值，繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel稀釋濃度為10 μg/μL后，包被Transwell小室，分隔成上下小室。將經(jīng)不同濃度黃芩素處理48 h后的SW620細(xì)胞調(diào)整濃度為1×105/mL，取200 μL加入上室，下室加入600 μL的完全培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)10 h。取出Transwell小室，并用PBS濕潤，然后用棉球擦去上室表面粘附的細(xì)胞，PBS洗滌2次。將Transwell小室用4%甲醛溶液固定15 min，乙醇脫水，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)上室遷移至微孔膜下層的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 免疫印跡Western blot檢測PTEN、Akt及p-Akt S473蛋白的表達(dá) 將濃度為5×104/mL的SW620細(xì)胞懸液以2 mL/孔的量接種于6孔培養(yǎng)板中，終濃度分別為0、25、50、75 μmol/L的黃芩素處理48 h后，棄去上清液，按照蛋白提取試劑盒的說明進(jìn)行蛋白提取，并測定其濃度。50 μg/孔總蛋白上樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗滌，PTEN、Akt、p-Akt S473，β-actin一抗孵育(1∶1 000)，4 ℃過夜，TBS洗滌3次，加入二抗(1∶5 000)孵育，洗滌，ECL顯色液顯色檢測蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究中每種檢測實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用()表示，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)差異通過t檢驗(yàn)或單因素方差分析來進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增生 為觀察黃芩素對(duì)SW620細(xì)胞的影響，本研究通過MTT和EdU實(shí)驗(yàn)檢測了經(jīng)黃芩素作用后的腫瘤細(xì)胞的生長及增生情況(圖1～2)。EdU結(jié)果顯示，各組經(jīng)0、25、50、75 μmol/L黃芩素處理24 h后處于S期的SW620細(xì)胞所所占比例分別為(58.11±5.77)%、(51.62±7.84)%、(48.75±5.44)%、(46.59±3.59)%，與0 μmol/L黃芩素處理組相比，75 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.05)；各組經(jīng)0、25、50、75 μmol/L黃芩素處理48 h后處于S期的結(jié)腸癌細(xì)胞所占的比例分別為(52.16%±5.05)%、(46.40%±6.75)%、(42.21%±5.21)%、(35.37%±4.12)%，與0 μmol/L黃芩素處理組相比，75 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細(xì)胞比例顯著降低(P＜0.01)。MTT結(jié)果顯示，黃芩素對(duì)SW620細(xì)胞具有直接抑制作用，并呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴性。

圖1 黃芩素對(duì)SW620細(xì)胞生長的影響

圖2 不同處理組SW620腫瘤細(xì)胞的生長曲線

2.2 黃芩素能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)分析經(jīng)黃芩素處理48 h后腫瘤細(xì)胞的侵襲力變化(圖3)。結(jié)果顯示，相對(duì)于0 μmol/L黃芩素處理組，50、75 μmol/L黃芩素處理組細(xì)胞遷移數(shù)量分別下降18.32%(P＜0.05)、40.72%(P＜0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 黃芩素對(duì)SW620細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 黃芩素對(duì)PTEN、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)的影響與0 μmol/L黃芩素處理組相比較，50、75 μmol/L黃芩素處理組PTEN蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，p-Akt低于對(duì)照組(P＜0.05，圖4)。

圖4 黃芩素對(duì)SW620細(xì)胞PTEN、Akt及p-Akt表達(dá)的影響

3 討論

來源于傳統(tǒng)中藥的黃酮類化合物黃芩素在多種腫瘤細(xì)胞中顯示出明顯的抗腫瘤活性。黃芩素能通過表皮生長因子受體通路抑制子宮頸癌細(xì)胞的增生[11]，通過降低12-LOX mRNA的途徑抑制肝癌細(xì)胞的增生并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[12]，食管癌細(xì)胞體外研究中，黃芩素還可作用于PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的增生與凋亡[13]。除影響腫瘤細(xì)胞的增生與凋亡外，黃芩素還能夠通過影響人胰腺癌腫瘤細(xì)胞偽足形成，導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲力下降[14]，通過降低MMP-2、整合素α2表達(dá)，抑制MG63細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[15]。

前期研究表明[16]，黃芩素能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增生與凋亡，改變凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。本研究通過EdU及MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了黃芩素對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞生長的影響。EdU結(jié)果表明，較高濃度的黃芩素(50、75 μmol/L)能夠顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的DNA復(fù)制活性，細(xì)胞生長受到影響。MTT結(jié)果顯示，經(jīng)黃芩素處理后，腫瘤細(xì)胞增生受到抑制，而且和藥物劑量及作用時(shí)間呈正相關(guān)。侵襲及轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤的重要特征，Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩素能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。

PTEN是一種人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，通過p53信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用[17-18]。PTEN能夠使磷脂酰肌醇磷酸酯類3位脫磷酸，其主要作用底物為PIP3，后者可以介導(dǎo)Akt的磷酸化使后者發(fā)生活化，其中，p-Akt(ser473)是其主要的活化形式之一。PTEN可以將PIP3脫磷酸為PIP2，抑制Akt的激活，下調(diào)PI3K/Akt傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞周期、細(xì)胞生長與分化的調(diào)控過程中起著重要的作用[19-20]。研究表明，在多種腫瘤的發(fā)生中，均存在PTEN基因的表達(dá)異常，多種mir-RNA均可通過PTEN/Akt途徑影響細(xì)胞的增生、侵襲與凋亡[21-24]。本研究WB結(jié)果顯示，黃芩素能夠增加SW620細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，降低Akt的活化(p-Akt ser473)，影響PTEN/Akt調(diào)節(jié)通路，提示黃芩素對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的影響可能是通過PTEN/Akt途徑來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究進(jìn)一步揭示了結(jié)腸癌細(xì)胞中黃芩素所表現(xiàn)出的抗腫瘤活性及其可能機(jī)制，為其臨床輔助抗腫瘤應(yīng)用提供了理論支持，但PTEN/Akt途徑是否為最主要的抗腫瘤機(jī)制以及其發(fā)揮抗腫瘤活性是否存在其他的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

[1]Ferlay J，Steliarova-Foucher E，Lortet-Tieulent J，et al.Cancer incidence and mortality patterns in Europe：estimates for 40 countries in 2012[J].Eur J Cancer，2013，49(6)：1374-1403.

[2]DesantisCE，Lin CC，MariottoAB，etal.Cancertreatment and survivorship statistics，2014[J].CA Cancer J Clin，2014，64(4)：252-271.

[3]陳萬青，張思維，鄭榮壽，等.中國2009年惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤，2013，22(1)：2-12.

[4]Hongchao Z，Taotao D，Houmin Z，et al.miR-320a suppresses colorectalcancerprogression by targeting Rac1[J].Carcinogenesis，2014，35(4)：886-895.

[5]Manpreet Kaur，Saini，Sankar Nath，et al.Cell cycle regulation and apoptotic cell death in experimental colon carcinogenesis：intervening with cyclooxygenase-2 inhibitors[J].Nutrition&Cancer，2015，67(4)：620-636.

[6]Grasso S，Martínez-Lacaci I，Barberá VM，et al.HGUE-C-1 is an atypical and novel colon carcinoma cell line[J].Bmc Cancer，2015，15(1)：1-16.

[7]Hsieh CJ，Hall K，Ha T，et al.Baicalein inhibits IL-1betaand TNF-alpha-induced inflammatory cytokine production from human mast cells via regulation of the NF-kappaB pathway[J].Clinical&Molecular Allergy Cma，2007，5(5)：5-14.

[8]Kyo R，Nakahata N，Sakakibara I，et al.Baicalin and baicalein，constituents of an important medicinal plant，inhibit intracellular Ca2+elevation by reducing phospholipase C activity in C6 rat glioma cells[J].J Pharm Pharmacol，1998，50(10)：1179-1182.

[9]Chen J，Li Z，Chen AY，et al.Inhibitory effect of baicalin and baicalein on ovarian cancercells[J].IntJMolSci，2013，14(3)：6012-6025.

[10]Ma Z，Otsuyama K，Liu S，et al.Baicalein，a component of Scutellaria radix from Huang-Lian-Jie-Du-Tang(HLJDT)，leads to suppression of proliferation and induction of apoptosisin human myeloma cells[J].Blood，2005，105(8)：3312-3318.

[11]鄒穎，遲宏罡，李濤，等.黃芩素對(duì)子宮頸癌Hela細(xì)胞表皮生長因子受體表達(dá)的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2014，25(2)：121-124.

[12]向淼，徐細(xì)明，鄧君健，等.黃芩素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡作用的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，20(6)：1098-1103.

[13]Zhang HB，Lu P，Guo QY，et al.Baicalein induces apoptosis in esophagealsquamous cellcarcinoma cells through modulation of thePI3KAktpathway[J].Oncology Letters，2013，5(2)：722-728.

[14]任學(xué)群，李宜雄.黃芩素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力的影響[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，29(3)：180-185.

[15]廖于，陳富，宴錚劍，等.黃芩素對(duì)MG63細(xì)胞侵襲浸潤能力的影響[J].中藥藥理與臨床，2011，27(2)：32-34.

[16]王寧，暢靈麗，程琦，等.黃芩素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015，25(35)：22-26.

[17]N Jones，F(xiàn) Bonnet，S Sfar，et al.Comprehensive analysis of PTEN status in breast carcinomas[J].International Journal of CancerJournalInternationalDu Cancer，2013，133(2)：323-334.

[18]Lindsey D Mayo，David B Donner.The PTEN，Mdm2，p53 tumor suppressor-oncoprotein network[J].Trends in Biochemical Sciences，2002，27(9)：462-467.

[19]NiZ，Kai-Ting Y，Jennifer-Ann B，etal.PTEN controls β-cell regeneration in aged mice by regulating cell cycle inhibitor p16(ink4a)[J].Aging Cell，2013，12(6)：1000-1011.

[20]Chu EC，Tarnawski AS.PTEN regulatory functions in tumor suppression and cell biology[J].Medical Science Monitor International Medical Journal of Experimental& Clinical Research，2004，10(10)：R-A235.

[21]Li X，Li Z，Li N，et al.MAGI2 enhances the sensitivity of BEL-7404 human hepatocellularcarcinoma cells to staurosporine-induced apoptosis by increasing PTEN stability[J].InternationalJournalof MolecularMedicine，2013，32(2)：439-447.

[22]Yang TS，YangXH，Wang XD，etal.MiR-214 regulate gastric cancercellproliferation，migration and invasion by targeting PTEN[J].Cancer Cell International，2013，13(1)：1-10.

[23]Fan W，Huang J，Xiao H，et al.MicroRNA-22 is downregulated in clear cell renal cell carcinoma，and inhibits cell growth，migration and invasion by targeting PTEN[J].Molecular medicine reports，2016，13(6)：4800-4806.

[24]Li B，Lu Y，Wang H，et al.miR-221/222 enhance the tumorigenicity of human breast cancer stem cells via modulation of PTEN/Akt pathway[J].Biomedicine&Pharmacotherapy，2016，79(4)：93-101.