乳腺癌中c-MYC調(diào)節(jié)的剪接基因鑒定及其臨床意義分析△

張永明，王一澎，馬飛

國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院1教育處，2乳腺外科，3腫瘤內(nèi)科，北京100021

RNA剪接是指從DNA模版鏈轉(zhuǎn)錄出的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本中去除內(nèi)含子，并將外顯子拼接在一起，產(chǎn)生成熟的信使RNA的過程。對(duì)于具有多個(gè)外顯子的基因而言，剪接過程產(chǎn)生了具有不同外顯子組成方式的信使RNA，并被翻譯成不同的蛋白產(chǎn)物，極大地豐富了基因組編碼蛋白的多樣性，對(duì)維持細(xì)胞的正常功能以及決定細(xì)胞和組織的特異性發(fā)揮著重要作用。RNA剪接過程調(diào)控紊亂與腫瘤及多種疾病有關(guān)。如在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控序列在剪接位點(diǎn)常發(fā)生基因突變，從而影響基因的選擇性剪接過程。剪接復(fù)合體核心組分的蛋白表達(dá)異常影響了剪接體的正常功能，與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。MYC癌蛋白是大多數(shù)人類腫瘤的主要驅(qū)動(dòng)因子，MYC可以結(jié)合到基因組中的活性調(diào)控元件上，廣泛擴(kuò)大基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞不受限制地生長(zhǎng)[2]。MYC開啟一組與剪接體組成元件相關(guān)的基因表達(dá)，剪接相關(guān)基因?qū)YC驅(qū)動(dòng)腫瘤形成起到至關(guān)重要的作用[3-4]。本研究通過分析乳腺癌多組學(xué)數(shù)據(jù)，鑒定MYC調(diào)控的剪接基因，并評(píng)價(jià)其潛在的預(yù)后價(jià)值，為深入研究MYC在乳腺癌中的作用機(jī)制，鑒定潛在的乳腺癌治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

利用癌癥和腫瘤基因圖譜（cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫調(diào)取乳腺癌數(shù)據(jù)集BreastⅠnvasive Carcinoma（TCGA，Provisional）數(shù)據(jù)，分析乳腺癌中與c-MYC共表達(dá)的基因；采用DAVⅠD（functional annotation bioinformatics microarray analysis）數(shù)據(jù)庫對(duì)c-MYC共表達(dá)的基因進(jìn)行功能富集分析；采用String蛋白數(shù)據(jù)庫分析剪接基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；利用TCGA數(shù)據(jù)庫調(diào)取BreastⅠnvasive Carcinoma（TCGA，Provisional）數(shù)據(jù)，分析剪接基因在基因組水平上的突變、擴(kuò)增和缺失情況；Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌中WDR77、GEMIN4、SNRPD1及其他剪接基因的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.2 熱圖繪制

采用Cluster 3.0和Java TreeView軟件繪制基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果

2.1 c-MYC共表達(dá)基因功能富集分析

調(diào)取并分析TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌數(shù)據(jù)集Breast Ⅰnvasive Carcinoma（TCGA，Provisional）的1105例乳腺癌數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示：與c-MYC共表達(dá)相關(guān)的基因共有519個(gè)（Pearson相關(guān)系數(shù)≥0.3）。采用DAVⅠD數(shù)據(jù)庫對(duì)519個(gè)基因進(jìn)行功能聚類，結(jié)果顯示：與c-MYC共表達(dá)相關(guān)的基因顯著富集核糖體生物合成、細(xì)胞周期、染色體分離、RNA剪接、DNA結(jié)合調(diào)節(jié)等功能。（圖1）

圖1 c-MYC共表達(dá)基因的功能富集

2.2 c-MYC對(duì)可變剪接基因的影響

功能富集結(jié)果顯示：與c-MYC共表達(dá)的基因中涉及RNA剪接的共有16個(gè)，其中PPP2CA基因的表達(dá)與c-MYC的表達(dá)在乳腺癌中呈負(fù)相關(guān)；其余15個(gè)基因的表達(dá)均與c-MYC的表達(dá)呈正相關(guān)，即c-MYC表達(dá)的升高伴隨著15個(gè)剪接基因的表達(dá)升高的現(xiàn)象，提示在乳腺癌中c-MYC參與調(diào)節(jié)異常剪接基因的轉(zhuǎn)錄。（圖2）

圖2 c-MYC與共表達(dá)基因的相關(guān)性分析

2.3 c-MYC調(diào)節(jié)的剪接基因互作網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用String蛋白數(shù)據(jù)庫分析c-MYC相關(guān)剪接基因互作網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果顯示：16個(gè)基因中有12個(gè)基因與RNA剪接具有密切聯(lián)系，主要是剪接體復(fù)合物、U12-型剪接體復(fù)合物和剪接體snSNP復(fù)合物，其中最主要的節(jié)點(diǎn)基因?yàn)镾NRPD1，其他基因的節(jié)點(diǎn)數(shù)目詳見圖3。

圖3 String蛋白數(shù)據(jù)庫分析可變剪接基因之間的聯(lián)系

2.4 剪接基因交集分析

在本研究分析的乳腺癌數(shù)據(jù)中，與c-MYC共表達(dá)的16個(gè)基因中有3個(gè)基因與已經(jīng)發(fā)表的淋巴瘤中的基因一致，分別為WDR77、GEMIN4和SNRPD1。WDR77、GEMIN4和SNRPD1基因與c-MYC基因在乳腺癌數(shù)據(jù)集中的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.32、0.47和0.30。（圖4）

圖4 淋巴瘤和乳腺癌c-MYC調(diào)節(jié)剪接基因交集分析

2.5 基因組水平檢測(cè)基因變化

調(diào)取TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌數(shù)據(jù)集BreastⅠnvasive Carcinoma（TCGA，Provisional），分析剪接基因在基因組水平上突變、擴(kuò)增和缺失的情況，結(jié)果顯示：16個(gè)剪接基因在乳腺癌中均有不同程度的擴(kuò)增，其中CPSF1、PUF60、TGS1和RBM17基因在乳腺癌中的擴(kuò)增比例較多，分別為16%、15%、9%和5%，詳見圖5。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示：c-MYC調(diào)節(jié)的剪接基因在基因組水平的拷貝數(shù)改變與基因mRNA表達(dá)之間存在相關(guān)性，詳見圖6。

圖5 剪接基因的突變、擴(kuò)增和缺失比例分析

2.6 對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響

圖6 剪接基因拷貝數(shù)變異與基因表達(dá)的相關(guān)性分析

對(duì)WDR77、GEMIN4、SNRPD1基因及其他剪接基因的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：與WDR77低表達(dá)的乳腺癌患者相比，WDR77高表達(dá)的乳腺癌患者的總生存期較長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankP=0.046）；WDR77高表達(dá)的乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存期明顯長(zhǎng)于WDR77低表達(dá)的乳腺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（logrankP=1.1×10-11）；GEMIN4高表達(dá)的乳腺癌患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期均短于GEMIN4低表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankP=0.031、4.2×10-6）；SNRPD1高表達(dá)的乳腺癌患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期均短于SNRPD1低表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankP=0.036、5.9×10-12）；另外，CPSF1、PPNA、SF1、LSM6、SRPK1、YBX1、RBM28和PUF60基因的表達(dá)也與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)。（圖7）

3 討論

圖7 WDR77、GEMIN 4和SNRPD 1基因高表達(dá)與低表達(dá)乳腺癌患者的生存曲線圖

可變剪接是生物多樣性的重要原因，屬于表觀遺傳學(xué)范疇，其通過不同的作用方式從同一條基因序列產(chǎn)生不同的mRNA序列從而合成功能不同的蛋白質(zhì)，使基因編碼更有效率?？勺兗艚釉诎l(fā)育、分化過程中發(fā)揮著重要作用。越來越多的證據(jù)表明：不同組織或細(xì)胞中往往存在異常的可變剪接事件與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。剪接異構(gòu)體通過調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖、激素應(yīng)答、細(xì)胞凋亡和化療反應(yīng)等過程中的基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由于腫瘤中普遍存在選擇性剪接異常，可變剪接異常逐漸被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展和治療的重要標(biāo)志。然而，其介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確[5-6]。

有研究表明，多種腫瘤中常見MYC的表達(dá)上調(diào)，并伴有腫瘤的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后，說明MYC是腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)基因[7-8]。雖然細(xì)胞通路基因的突變可為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供最初的信號(hào)，但轉(zhuǎn)錄的異常可以引起廣泛的細(xì)胞生理學(xué)變化，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；同時(shí)，基因表達(dá)程序組成部分的增加，使細(xì)胞能夠適應(yīng)多種突變，使腫瘤細(xì)胞變得活躍[9]。研究發(fā)現(xiàn)，一些促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的剪接調(diào)節(jié)蛋白是MYC的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，其中包括hnRNP A1和hnRNP A2，而MYC誘導(dǎo)上調(diào)的二者能調(diào)節(jié)丙酮酸激酶的選擇性剪切，進(jìn)而促進(jìn)與腫瘤相關(guān)的丙酮酸激酶M2的表達(dá)[10]。靶向剪接體通路，剪接復(fù)合體蛋白以及腫瘤相關(guān)基因的選擇性剪接過程的治療方法，可以為腫瘤靶向治療提供新的策略[1,11-12]。近些年，人們正嘗試通過可變剪接進(jìn)行腫瘤診斷和治療，剪接體是MYC驅(qū)動(dòng)的腫瘤中一個(gè)治療新靶點(diǎn)，因?yàn)樵贛YC驅(qū)動(dòng)的腫瘤中，腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展對(duì)剪接體蛋白表達(dá)的依賴性增強(qiáng)，但是目前仍沒有阻斷該基因發(fā)揮作用的有效方法，通過抑制腫瘤細(xì)胞中剪接體的功能或許可以有效抑制腫瘤的進(jìn)展[1]。Hsu等[13]發(fā)現(xiàn)BUD31為乳腺上皮細(xì)胞中的MYC合成致死基因，并證明BUD31是核心剪接體組裝和催化活性所需的組分，敲降BUD31表達(dá)能干擾剪接體活動(dòng)并損害MYC依賴性乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移。在MYC驅(qū)動(dòng)的淋巴瘤中，使用相應(yīng)的反義寡核苷酸能使Eμmyc B細(xì)胞出現(xiàn)增殖減緩和誘導(dǎo)凋亡的特征[4]。因此，較深入地研究并揭示剪接體在腫瘤發(fā)病與進(jìn)展中的機(jī)制，同時(shí)針對(duì)不同剪接體設(shè)計(jì)靶向藥物對(duì)于腫瘤的診斷和治療具有重要意義。

Hsu等[13]在乳腺癌中直接對(duì)c-MYC調(diào)控的剪接因子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性分析，但缺少多樣本剪接因子表達(dá)分析，為此本研究組進(jìn)行了多腫瘤樣本的c-MYC調(diào)控表達(dá)對(duì)剪接的影響。本研究分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中與c-MYC共表達(dá)的基因有519個(gè)，其中可變剪接基因有16個(gè)。剪接基因中有15個(gè)基因表達(dá)伴隨c-MYC表達(dá)升高而升高。Cheryl M.Koh團(tuán)隊(duì)[4]研究發(fā)現(xiàn)，在淋巴瘤中c-MYC參與調(diào)控RNA剪接復(fù)合體核心組裝基因的轉(zhuǎn)錄，其中c-MYC直接調(diào)節(jié)的核心SNRP組裝基因中21個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，且本研究與Koh等在淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的剪接基因存在3個(gè)重疊基因，即WDR77、GEMIN4和SNRPD1，提示W(wǎng)DR77、GEMIN4和SNRPD1這些剪接基因在c-MYC驅(qū)動(dòng)乳腺癌的進(jìn)展中具有重要作用[4]。這16個(gè)剪接基因在基因組水平上有不同程度的缺失和擴(kuò)增；生存分析表明WDR77、GEMIN4和SNRPD1與患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期顯著相關(guān)，提示與c-MYC相關(guān)的剪接基因在乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用。

綜上所述，c-MYC調(diào)節(jié)的剪接基因在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色，本研究為乳腺癌的治療和預(yù)后評(píng)估提供了重要參考價(jià)值，但關(guān)于c-MYC如何調(diào)節(jié)剪接基因的表達(dá)及剪接基因如何介導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展還需進(jìn)一步研究，同時(shí)充分了解c-MYC影響剪接的具體機(jī)制可能對(duì)未來的靶向MYC依賴性的腫瘤治療提供重要理論依據(jù)。

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