張 婷,陳小偉,張 琪,張沙沙,薛淑龍,蔣立新,范昊安,程勇杰,姚 剛,于林凱,毛建衛(wèi),蔡海鶯*
(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實驗室,浙江 杭州 310023;3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310023)
木薯(Manihot esculentaCrantz)又名南洋薯、樹薯,與甘薯、馬鈴薯并稱之為世界三大薯類。其原產(chǎn)地為美洲熱帶,19世紀(jì)20年代中國成功引入,目前廣泛分布于廣西、廣東和海南等地區(qū)。木薯富含礦物質(zhì)、維生素、微量元素和大量碳水化合物,其中淀粉含量為10%~30%,蛋白質(zhì)含量約為1%~2%,纖維素含量約為1%~2%,脂肪含量約為0.3%~4.3%[1-2],因此其獲得“地下糧倉”之美譽(yù)。但木薯含有少量有毒物質(zhì)——氰化物,需要有效的脫毒技術(shù)來降低甚至去除其毒性。SAKA J D K等[3]采用水浸法測定剝皮和未剝皮木薯塊根的總生氰糖苷減少量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)剝皮后的木薯塊根總生氰糖苷去除率達(dá)到97.902%。甜木薯是木薯種類之一,其生氰糖苷含量極低,所以可供人安全食用,但它不耐貯藏,保質(zhì)期較短,加工成發(fā)酵酒后卻易于保存。COLEHOUR A M等[4]發(fā)現(xiàn)了厄瓜多爾亞馬遜地區(qū)的本土人每天都食用木薯酒;黃發(fā)新等[5]以粗木薯粉為原料,以米曲霉作液化劑、黑曲霉作糖化劑及酒母作發(fā)酵劑釀造木薯白酒;古碧等[6]以非即食型食用的木薯全粉為原料加甜酒曲釀造風(fēng)味獨(dú)特的甜酒。這些都有力說明釀造甜木薯酒具有可行性。甜木薯發(fā)酵酒是主要通過新鮮甜木薯加酒曲直接釀造而成的生物發(fā)酵產(chǎn)品,富有甜味或半甜味,其含有的營養(yǎng)成分和微量代謝物質(zhì)與其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的特殊風(fēng)味物質(zhì)密切相關(guān)。
在發(fā)酵過程中,甜木薯酒中的微生物通過代謝作用產(chǎn)生酸、醇、酯等香氣物質(zhì)。其中有機(jī)酸是甜木薯酒的重要呈味物質(zhì),直接影響酒的口感品質(zhì)。然而目前國內(nèi)乃至國際上有關(guān)木薯酒的有機(jī)酸等方面研究少見報道。但其他甘薯酒的有機(jī)酸等方面研究較多,如HAN X等[7]以冀紫薯1號為原料釀造紫甘薯紅酒。研究結(jié)果表明,當(dāng)料液比為1∶3(g∶mL),紫薯經(jīng)液化、糖化和加酵母菌發(fā)酵,在23℃、pH 4.0的條件下發(fā)酵7 d后的紫甘薯紅酒中含有L-蘋果酸、酒石酸和琥珀酸等9種有機(jī)酸。
本研究以新鮮甜木薯為原料,采用甜酒曲液化糖化、發(fā)酵成木薯酒的方法,對酒中還原糖含量、酒精度、pH值及總酸含量的變化趨勢進(jìn)行研究,且利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析木薯酒發(fā)酵期間的主要有機(jī)酸種類及含量的動態(tài)變化,進(jìn)而探討木薯酒酸味味道強(qiáng)度和味感特性。以期有利于木薯資源的開發(fā)和利用,并為木薯酒風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ),進(jìn)一步促進(jìn)酒業(yè)市場的繁榮。
白肉甜木薯:海南省??谑械哪臼砘兀粡V西香蜜甜酒粉:南寧廣龍工貿(mào)有限責(zé)任公司。
丙酮酸(純度98.0%)、琥珀酸(純度99.0%)、L-酒石酸(純度99.5%):美國Sigma公司;草酸(純度≥98.0%)、L-蘋果酸(純度≥98.0%)、檸檬酸(純度≥98.0%):中國食品藥品檢定研究院;乙酸(純度≥99.7%)、乳酸(純度≥98.0%)、磷酸二氫鉀(色譜純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇(色譜純):美國天地有限公司;磷酸(色譜純):上海長哲生物科技有限公司。其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。
FA2004電子天平:上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;UV-5500PC型紫外分光光度計:上海市元析儀器有限公司;Allegra X-12R冷凍離心機(jī):美國貝克曼庫爾特有限公司;PHS-3C精密酸度計:上海佑科儀器儀表有限公司;Waters e2695高效液相色譜:美國waters公司。
1.3.1 木薯酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)
新鮮甜木薯→清洗→去皮→切片→蒸煮→冷卻→加水打漿→拌曲發(fā)酵→過濾→高溫殺菌→成品
操作要點(diǎn):新鮮甜木薯原料要求無蟲害、無霉變,清洗干凈,削皮,切成8~10 mm厚度的塊狀,常壓蒸煮至熟而不爛,蒸煮后冷卻至常溫,加水進(jìn)行打漿,配制成50%熟木薯打漿液,再以550∶0.5的質(zhì)量比例放入甜酒曲并攪拌,嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵時間為84 h,每12 h取3個平行酒樣,且酒樣于10 000 r/min條件下離心20 min,取上層清液置于-85℃超低溫冰箱儲存,待測其還原糖、酒精度、pH、總酸及有機(jī)酸含量。發(fā)酵期間,前2 d微生物生長旺盛,產(chǎn)生大量的CO2,應(yīng)及時排氣。以木薯酒中還原糖含量和酒精度不再變化時,結(jié)束發(fā)酵。
1.3.2 分析檢測
木薯酒的還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)比色法[8];酒精度的測定采用國標(biāo)GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》;pH值:pH值測定采用酸度計;總酸含量的測定采用國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的指示劑法;有機(jī)酸含量的測定采用高效液相色譜法,具體色譜條件如下:Agilent TC C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為甲醇,流動相B 0.02 mo1/L KH2PO4溶液(用H3PO4調(diào)pH至2.7),且流動相A/B(2∶98,V/V);液相條件為等梯度洗脫20 min,流速為1 mL/min,柱溫為25 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,檢測波長為210 nm。
準(zhǔn)確稱取丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品15.000 mg,用超純水溶解并定容到10 mL容量瓶中,搖勻,配制1.5 mg/mL的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以相同的方法依次配制草酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸與琥珀酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后將以上各標(biāo)準(zhǔn)溶液配制混標(biāo),4℃冷藏保存。以混標(biāo)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照有機(jī)酸出峰時間及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別對樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行定性定量分析。
1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
實驗中的檢測分析包括木薯酒的還原糖、酒精度、pH、總酸和有機(jī)酸種類及含量。所有線性方程、重復(fù)性和準(zhǔn)確性實驗的樣品數(shù)據(jù)均由Excel 2010計算得出,樣品處理后的所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,且每個數(shù)據(jù)點(diǎn)3個重復(fù),并用Origin86與SPSS16.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖。
酒糖度可反映其甜味,發(fā)酵過程中的酒甜味變化對口感會產(chǎn)生一定的影響。香蜜甜酒曲含有根霉和酵母兩種微生物。由于微生物能利用的可發(fā)酵性糖大都是還原糖和低聚糖,木薯酒中還原糖含量變化過程如圖1所示。
圖1 不同發(fā)酵時間的木薯酒還原糖含量變化Fig.1 Changes of reducing sugar contents in cassava wine at different fermentation time
在發(fā)酵過程中,復(fù)雜碳水化合物降解產(chǎn)生的還原糖不僅能給予酒甜味,同時也是微生物的營養(yǎng)物質(zhì)。從圖1可看出,發(fā)酵24 h期間,酒中的還原糖含量隨發(fā)酵時間延長而快速增加,24 h時達(dá)到還原糖含量的最高峰。發(fā)酵24 h后的還原糖含量先快速下降后降低趨緩,最終減少至54.67 mg/mL。與LUO H等[9]研究白酒中的微生物生態(tài)因子動力學(xué)的結(jié)果相似。結(jié)果表明,發(fā)酵前期,由于霉菌的糖化作用極為旺盛,白酒中的還原糖含量一直上升。隨著發(fā)酵進(jìn)行,酵母菌等微生物繁殖速率較快,消耗大量還原糖,使還原糖又呈下降趨勢。因此木薯酒中還原糖的降低,可能由于產(chǎn)酸菌、產(chǎn)酯菌等微生物將可發(fā)酵性的糖類用于自身生長及代謝。但木薯酒中的糖分并非全部轉(zhuǎn)化為酒精,總有一部分糖殘留,給予酒體甜潤和稠厚感。
酒中的醇類物質(zhì)是由霉菌、酵母和細(xì)菌等微生物利用糖、氨基酸及脂肪等成分而生成的主要代謝產(chǎn)物,包括一元醇、多元醇和芳香醇[10]。其中酒精是酒發(fā)酵的主要產(chǎn)物,其生成量的多少是鑒定出酒質(zhì)量的主要指標(biāo),也是判斷發(fā)酵是否正常的重要依據(jù)。木薯酒中酒精度變化過程如圖2所示。
由圖2可知,在發(fā)酵前12 h,木薯酒中酒精度增長緩慢,在發(fā)酵12~36 h時迅速上升。這主要由于在發(fā)酵初期,微生物的增殖速率較慢,對酒中可發(fā)酵性糖類的利用率較低。隨著發(fā)酵進(jìn)行,酒中的可發(fā)酵性糖濃度升高,使微生物能利用糖類進(jìn)行酒精發(fā)酵,從而產(chǎn)生大量酒精。但在后發(fā)酵期間,酒中還原糖含量逐漸減少,再加上發(fā)酵產(chǎn)物酒精抑制微生物的增殖,所以酒精度在36~84 h先緩慢上升后平穩(wěn)在7.11%vol。說明大量微生物在發(fā)酵60~84 h處于衰老階段,此時發(fā)酵基本結(jié)束。
圖2 不同發(fā)酵時間的木薯酒酒精度變化Fig.2 Changes of alcohol contents in cassava wine at different fermentation time
酒pH值與總酸含量有密切的聯(lián)系,且總酸含量可反映其酸味,發(fā)酵過程中的木薯酒酸度變化也會對口感產(chǎn)生一定的影響。根霉能產(chǎn)生糖化酶,將淀粉水解成還原糖及低聚糖類等以及少量的有機(jī)酸[11-12]。在厭氧環(huán)境下,酵母菌利用根霉糖化淀粉所產(chǎn)生的糖類酵解為酒精和酸[12]。木薯酒的pH值及總酸含量變化過程如圖3所示。
圖3 不同發(fā)酵時間木薯酒pH值與總酸含量變化Fig.3 Changes of pH and total acid contents in cassava wine at different fermentation time
由圖3可知,在0~84 h的發(fā)酵過程中,木薯酒的總酸趨勢先緩慢降低再緩慢增加,后快速增加,與pH值變化趨勢相反??赡芤驗榘l(fā)酵初期微生物繁殖所需能源和碳源物質(zhì)不足,導(dǎo)致有機(jī)酸被消耗利用。到12 h后的木薯酒中微生物增殖速率快,從而產(chǎn)生有機(jī)酸。發(fā)酵后期發(fā)酵產(chǎn)生的酒精又被氧化成有機(jī)酸,從而引起總酸含量的增加。因此,在發(fā)酵過程中應(yīng)控制微生物的代謝作用,調(diào)節(jié)總酸的生成量,保證木薯酒產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。
2.4.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
按照色譜條件,8種有機(jī)酸的分離效果較好(見圖4)。以各標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸質(zhì)量濃度(x)對峰面積(y)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表1。由表1可知,各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均≥0.996,表明二者線性關(guān)系良好。
圖4 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of organic acids mixed standards
表1 8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析Table 1 Regression analysis of standard curves of eight organic acids standards
2.4.2 發(fā)酵前后的有機(jī)酸組分和含量分析
傳統(tǒng)木薯酒的有機(jī)酸部分來源于木薯本身,另一部分來源于酒精發(fā)酵、乙酸或蘋果酸-乳酸發(fā)酵。通過HPLC對酒發(fā)酵期間包括乳酸、乙酸、檸檬酸在內(nèi)的8種有機(jī)酸進(jìn)行分析,采用外標(biāo)法測定其有機(jī)酸種類及含量,其動態(tài)變化的研究結(jié)果見表2。
表2 木薯酒發(fā)酵過程中的有機(jī)酸組成及動態(tài)變化Table 2 Composition and dynamic changes of organic acids in fermentation process of cassava wine mg/mL
木薯原料的成熟程度會引起酒的有機(jī)酸組成和含量變化。通常有機(jī)酸是在木薯生長過程中積累,在成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環(huán)等呼吸基質(zhì)以及糖原異生作用基質(zhì)而被消耗[13]。從表2可看出,乳酸、乙酸、琥珀酸和檸檬酸是新鮮木薯的主體有機(jī)酸,其中乳酸含量最高。與李姍姍等[14]的研究結(jié)果類似,從木薯塊根經(jīng)乙醇提取后的化學(xué)物質(zhì)的波譜分析表明:木薯塊根含有乳酸和琥珀酸。PICHADH等[15]采用HPLC分析生、熟甘薯塊根中的有機(jī)酸,研究表明生、熟甘薯有機(jī)酸均以蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸為主,少量含有草酸。
發(fā)酵過程中微生物的代謝也會引起酒的有機(jī)酸組成和含量變化。表2結(jié)果表明,木薯酒有機(jī)酸種類豐富,且隨著發(fā)酵菌種生長與代謝而發(fā)生改變。在發(fā)酵期間,酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸是木薯酒中有機(jī)酸的重要組成部分,其中主要有機(jī)酸為乳酸,這可能是由于木薯酒在發(fā)酵過程中以同型或異型乳酸發(fā)酵為主,大部分葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的結(jié)果[16]。草酸、丙酮酸、蘋果酸等含量相對較少,是酒中的輔助酸味有機(jī)酸,這形成了傳統(tǒng)木薯酒豐富的酸味味感。發(fā)酵后期木薯酒中的蘋果酸含量逐漸降低,可能因為酒通過三羧酸循環(huán)合成,產(chǎn)生蘋果酸、檸檬酸,蘋果酸通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵又被轉(zhuǎn)化成酒精或乳酸。與趙鶴然[17]研究葡萄酒發(fā)酵過程中的蘋果酸變化結(jié)果一致。DRIEHUIS F等[18]發(fā)現(xiàn)乳酸菌在厭氧條件下具有降解乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸的能力。而乙酸是木薯酒中揮發(fā)性有機(jī)酸的主要成分,含量少時帶有愉快的醋香味。木薯中的谷氨酸由于其降解代謝,使木薯酒中的琥珀酸積累。TSUJI A等[19]研究表明丙酮酸、檸檬酸及琥珀酸是碳代謝的中心物質(zhì)。
酒中有機(jī)酸的種類、含量及構(gòu)成受原料、酒曲、釀造條件等多種因素影響[20],對酒的風(fēng)味有很大影響。酒利用酒曲中的微生物進(jìn)行恒溫發(fā)酵,會產(chǎn)生多種酸味物質(zhì),但對酸味起主要作用的是酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸。代謝產(chǎn)物乳酸、乙酸等有機(jī)酸對木薯酒的風(fēng)味影響顯著,且比例協(xié)調(diào)地抑制酒發(fā)酵過程中的雜菌生長,增強(qiáng)酒的醇厚感,促進(jìn)芳香酯的形成。基于酸的濃度和酸味之間并不呈現(xiàn)一種簡單的相互關(guān)系[21],本研究參考酒類產(chǎn)品有機(jī)酸的閾值[22-23](見表3)并結(jié)合味道強(qiáng)度值taste active value,TAV)(TAV值為樣品中呈味有機(jī)酸在樣品中的含量與其對應(yīng)的呈味閾值之比。)分析法對木薯酒中呈味有機(jī)酸的呈味貢獻(xiàn)進(jìn)行分析不同發(fā)酵時間的樣品各呈味有機(jī)酸TAV分析見表4。
表3 7種呈味有機(jī)酸閾值與酸味特性Table 3 Threshold value and sour taste characteristics of seven kinds of taste organic acids
表4 不同發(fā)酵時間的有機(jī)酸味道強(qiáng)度值分析Table 4 TAV analysis of organic acids with different fermentation time
不同有機(jī)酸對酒中風(fēng)味貢獻(xiàn)不同。由表4可知,在發(fā)酵期間,酒中丙酮酸的TAV值始終<0.5,風(fēng)味不顯著;TAV值>2的是乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸,表明乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸是影響傳統(tǒng)木薯酒口感的重要有機(jī)酸。酒石酸、蘋果酸作為酒的輔助酸味特征成分。
發(fā)酵84h的木薯酒有最高的味道強(qiáng)度,發(fā)酵12h樣品最低。影響木薯酒酸味特性的主要是乳酸和乙酸,還有獨(dú)特的檸檬酸。在發(fā)酵期間,木薯酒中的七種呈味有機(jī)酸總含量變化與總味道強(qiáng)度變化趨勢一致,其中乳酸的含量變化趨勢也與之一樣,這說明發(fā)酵過程中各有機(jī)酸的消長影響酒的味道強(qiáng)度,尤其乳酸的消長。雖然TAV值這一概念沒有考慮到某些成分的協(xié)同作用或抵消作用對酒中風(fēng)味的影響,仍有一定的局限性,但TAV值仍不失為釀造者評價其產(chǎn)品和生產(chǎn)方法的有用參考依據(jù)[23]。
2.6.1 相關(guān)性分析
對不同發(fā)酵時間的木薯酒各呈味有機(jī)酸量之間,呈味有機(jī)酸量與總味道強(qiáng)度進(jìn)行Pearson法相關(guān)分析,結(jié)果見表5。由表5可知,乳酸與乙酸變化呈顯著正相關(guān)(P<0.01),琥珀酸與酒石酸變化具有顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05),總味道強(qiáng)度與乳酸、乙酸變化呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。
表5 發(fā)酵過程中的各呈味有機(jī)酸與總味道強(qiáng)度的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of taste organic acids and total taste intensity during fermentation process
2.6.2 聚類分析
對不同發(fā)酵時間的木薯酒各呈味有機(jī)酸味感貢獻(xiàn)進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖5。由圖5可知,其中1~6分別代表發(fā)酵時間為0、12 h、24 h、36 h、60 h和84 h。根據(jù)發(fā)酵時間,可以將呈味有機(jī)酸聚類為3類。即第1類:0、12 h,第2類:24 h、36 h,第3類:60 h、84 h。聚類分析的結(jié)果代表著在不同發(fā)酵時間,呈味有機(jī)酸量及總味感強(qiáng)度的變化趨勢一致,皆是先緩慢增加,后快速增加再呈趨緩的總趨勢。
圖5 發(fā)酵不同時間的各呈味有機(jī)酸與總味道強(qiáng)度的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of taste organic acids and total taste intensity with different fermentation time
本研究以新鮮甜木薯為原料,經(jīng)香蜜甜酒曲通過短時間發(fā)酵而釀造木薯酒產(chǎn)品,對發(fā)酵過程中酒品質(zhì)進(jìn)行動態(tài)跟蹤及分析。研究發(fā)現(xiàn):在發(fā)酵期間,木薯酒還原糖先快速增加至最高點(diǎn)然后降低趨緩,最終減少至54.67 mg/mL。酒精度先上升后平穩(wěn)在7.11%vol。總酸含量先緩慢降低至2.21 mg/mL,再緩慢上升,后快速上升,與pH值變化趨勢相反。本研究通過甜酒曲發(fā)酵木薯酒的品質(zhì)分析,為木薯酒的釀造、加工提供一定的參考價值。
本研究采用HPLC分析木薯酒發(fā)酵期間的有機(jī)酸。研究表明:乳酸、乙酸、琥珀酸和檸檬酸是新鮮木薯的主體有機(jī)酸,其中乳酸含量最高,達(dá)到1.925 mg/mL。在發(fā)酵期間,酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸是木薯酒中有機(jī)酸的重要組成部分,分別占木薯酒總有機(jī)酸含量的2.664%~12.306%,41.503%~63.527%,18.208%~23.819%,1.220%~27.766%,3.165%~15.889%,草酸、丙酮酸、蘋果酸等含量相對較少,是酒中的輔助酸味特征成分,這形成了木薯酒豐富的酸味味感。在酸味味感強(qiáng)度分析中,乳酸和乙酸是木薯酒的主體酸,發(fā)酵期間其TAV值占總TAV值為65.824%~95.835%,影響酒的酸味特性,賦予木薯酒一定的酸味。其中發(fā)酵84 h的木薯酒有最高的TAV值,其可達(dá)到223.865。本研究為進(jìn)一步開發(fā)發(fā)酵酒功能性產(chǎn)品提供實驗依據(jù)。
本研究通過木薯酒發(fā)酵過程中還原糖、酒精度、pH值、總酸及有機(jī)酸等動態(tài)變化,以把握發(fā)酵過程中主要有機(jī)酸的演變規(guī)律,為木薯酒品質(zhì)影響的研究奠定基礎(chǔ)。后續(xù)的研究應(yīng)對酒中香氣成分、多酚物質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行分析,進(jìn)一步研究木薯酒的香品質(zhì)與抗氧化特性變化,最終實現(xiàn)發(fā)酵木薯酒的現(xiàn)代化生產(chǎn)工藝。
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