響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇豆醬的制曲工藝

胡文康，孫 莉，熊 坤，付 彬，沈婉瑩，付彩霞，高 冰，汪 超，徐 寧*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068；

2.湖北省恩施土家族苗族自治州食品藥品檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000；3.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

豆醬是以豆類為主要原料，利用米曲霉等多種微生物共同發(fā)酵而制成的一種風(fēng)味食品[1]。豆醬是我國歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵品，其的出現(xiàn)可以追溯到周朝，是最早關(guān)于我國先民制作豆醬所使用原料及工藝的文字記錄。豆醬制作過程中的每一環(huán)節(jié)都至關(guān)重要，而制曲過程更是其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，在制曲過程中，許多因素都會影響最終豆醬成曲的質(zhì)量。制曲過程為微生物的生長提供一系列條件，使其能夠大量繁殖，從而可以產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等。酶的種類及活力的強弱直接決定了原料中蛋白質(zhì)、淀粉類物質(zhì)等的水解效果，最終影響所產(chǎn)豆醬風(fēng)味、口感和品質(zhì)。

紫蘇（Perilla frutescens）別名紅蘇、赤蘇，系一年生唇形科草本植物[2]。紫蘇的營養(yǎng)豐富，其中含有蛋白質(zhì)、多種維生素及礦物質(zhì)，還含有多酚、α-亞麻酸、黃酮和紫蘇醇等活性物質(zhì)[3]。這些物質(zhì)使得紫蘇具有抗氧化[4]、延緩機體衰老、改善記憶力的能力，同時兼具抗菌[5]、抗過敏[6]、抑制腫瘤[7]、降血脂[8]等多種作用。紫蘇曾經(jīng)被忽視的狀況隨著人民群眾生活水平的日益提高而逐漸消失，其作為一種藥食兼用植物[9-10]已經(jīng)在食品、醫(yī)藥以及香料等行業(yè)大放異彩[11-13]，市面上出現(xiàn)越來越多紫蘇產(chǎn)品。利用紫蘇和大豆共同發(fā)酵生產(chǎn)的紫蘇豆醬，能夠充分發(fā)揮紫蘇的營養(yǎng)價值和獨特風(fēng)味，豐富傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品的種類。

多酚是一種具有抗衰老、消除自由基和抗氧化作用的食品抗氧劑[14]。作為豆醬主要原料的大豆中有多種含酚結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì)，在發(fā)酵時通過米曲霉等作用將會產(chǎn)生對豆醬風(fēng)味和功能具有貢獻的酚類物質(zhì)。此外酚類也是紫蘇中主要的次生代謝產(chǎn)物，通過微生物發(fā)酵有利于酚類物質(zhì)的溶出。

本研究根據(jù)豆醬制曲過程中影響成曲品質(zhì)的主要因素進行試驗，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以成曲中總酚含量做為響應(yīng)值進行響應(yīng)面試驗，得到紫蘇豆醬最優(yōu)制曲工藝，為紫蘇豆醬制備提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇粉：湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)集團；黃豆、面粉：市售；米曲霉（Aspergillus oryzae）AS 3.951（滬釀 3.042）、黑曲霉Aspergillusniger）AS3.350：湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心；福林酚、碳酸鈉和甲醇：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸（純度為99%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXSR-1270生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；UV-1601紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；YM50-FY50壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；Biosafer-10D臺式凍干機：賽飛中國有限公司；CT15RE離心機：日立工機株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 成曲工藝流程

1.3.2 制曲環(huán)節(jié)流程

曲料配方為黃豆∶面粉=6.5∶3.5（g∶g），在試驗組中添加紫蘇粉代替部分面粉，再接入霉菌（米曲霉和黑曲霉）制得種曲。黃豆經(jīng)潤水環(huán)節(jié)浸泡后，將黃豆在121℃條件下高壓蒸煮20 min，待其冷卻，接入種曲拌勻。置于制曲室中在34℃條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)10～12 h后，對其進行松曲，再培養(yǎng)19～22 h后，進行第二次松曲。將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)至28～30℃，保持該溫度培養(yǎng)直至制曲結(jié)束。

1.3.3 單因素試驗

將紫蘇粉添加量、米曲霉與黑曲霉的復(fù)配比（以下簡稱為菌種復(fù)配比）、接種量和制曲時間為評價因素，依據(jù)表1中的因素水平和試驗條件，采用1.3.1中的流程進行制曲。得到成曲后，檢測其中的總酚含量?？疾煲陨?個因素各對成曲中總酚含量的影響。每個試驗平行進行3次，取其測量結(jié)果平均值。

因素 水平 固定條件

紫蘇粉添加量/%3、7、11、15接種量0.3%、菌種復(fù)配比3∶1、制曲時間40 h接種量/%0.2、0.3、0.4、0.5紫蘇添加量11%、菌種復(fù)配比3∶1、制曲時間40 h菌種復(fù)配比（g∶g）2∶1、3∶1、4∶1、5∶1紫蘇添加量11%、接種量0.3%、制曲時間40 h制曲時間/h 36、40、44、48紫蘇添加量11%、接種量0.3%、菌種復(fù)配比3∶1

1.3.4 制曲工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

在1.3.3中所述單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理[15]，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析試驗，其因素與水平見表2。

表2 制曲工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis for koji-making technology optimization

1.3.5 總酚的提取及含量測定

成曲中總酚的提取方法參考XU L等[16]的報道，稱取10g冷凍干燥的成曲樣品，溶于100mL體積分數(shù)70%的甲醇溶液中，室溫超聲處理15min，隨后在離心機中以10000r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。殘余底液繼續(xù)用上述方法提取，共提取3次。合并3次離心所得的上清液用于檢測總酚含量。

總酚含量檢測方法參考XU B J等[17]的報道。取0.5 mL樣品于10 mL比色管中，加入5.0 mL 10%福林酚后，室溫條件下靜置。待其反應(yīng)5 min后，再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，并用去離子水補充至10 mL，搖至均勻，室溫條件下靜置。靜置1 h后在波長760 nm處測其吸光度值。以沒食子酸為標準品作標準曲線，結(jié)果以每克樣品中含有的沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示（mg GAE/g）。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

上述試驗所得數(shù)據(jù)使用Design Expert 8.0.5b及SPSS軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響

紫蘇中含有大量的酚類物質(zhì)，而酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化活性，發(fā)酵可顯著提高原料中酚類物質(zhì)的含量[18]。以不加紫蘇的組別作為空白對照，紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響見圖1。由圖1可知，總酚含量隨著紫蘇粉添加量的增加，出現(xiàn)了先升后降的趨勢，在紫蘇粉添加量為11%時，成曲中總酚的含量達到最高，為5.74 mg GAE/g，與對照組相比，提高了39.6%；繼續(xù)添加紫蘇粉至15%時，比對照組提高了22.8%。適量加入紫蘇粉的確可以提高成曲中總酚含量，但過量加入紫蘇粉，其含有的黃酮、多酚等物質(zhì)反而會抑制微生物的生長，影響酶系的分泌，進而造成成曲中總酚含量降低。故在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將紫蘇粉添加量定為7%、11%和15%。

圖1 紫蘇粉添加量對成曲中總酚含量的影響Fig.1 Effects of different perilla powder addition on the content of total phenols in finished koji

2.1.2 接種量對成曲中總酚含量的影響

以不加紫蘇的組別作為空白對照，接種量對成曲中總酚含量的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)接種量為0.3%時，成曲中總酚含量達到最大，為5.81mgGAE/g，當(dāng)接種量＞0.3%時，成曲中總酚含量開始減少，這是由于接種量過大會使得曲料內(nèi)菌種的數(shù)量增加，使其對原料中可利用營養(yǎng)物質(zhì)的競爭加劇，導(dǎo)致其中部分菌體由于無法獲得充足的養(yǎng)分而生長遲緩，進而影響到了最終菌種孢子的成熟，蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等酶系的分泌也隨之減少，因此成曲中酚類物質(zhì)含量反而下降[19]。故在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將接種量定為0.3%、0.4%和0.5%。

圖2 接種量對成曲中總酚含量的影響Fig.2 Effects of inoculum on the content of total phenols in finished koji

2.1.3 菌種復(fù)配比對成曲中總酚含量的影響

米曲霉單菌種制曲存在曲酶系不足的缺陷，而通過多菌種混合制曲不僅可以彌補這一不足，同時還可以提高所制成曲中的總酚含量，這能增加其抗氧化活性物質(zhì)，提高成曲的品質(zhì)，以不加紫蘇的組別作為空白對照，不同米曲霉與黑曲霉的復(fù)配比對總酚含量的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)米曲霉與黑曲霉的比例為3∶1（g∶g）時，成曲中總酚含量達到最大，為6.02mgGAE/g。而加大這一比例后，其總酚含量反而減少，這可能是因為黑曲霉接種比例的減少，導(dǎo)致成熟的黑曲霉孢子數(shù)不足，影響酶的分泌，從而使成曲中酚類物質(zhì)含量下降。故在響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將米曲霉與黑曲霉的復(fù)配比定為3∶1、4∶1和5∶1（g∶g）。

圖3 菌種復(fù)配比對成曲中總酚含量的影響Fig.3 Effects of different compound strains ratio on the content of total phenols in finished koji

2.1.4 制曲時間對成曲中總酚含量的影響

制曲時間過短，會導(dǎo)致菌絲不能充分生長，且影響成曲品質(zhì)，總酚含量較低；而制曲時間過長，則會沾染產(chǎn)生雜菌，導(dǎo)致最后成曲質(zhì)量及其中總酚含量下降。以不加紫蘇的組別作為空白對照，制曲時間對成曲中總酚含量的影響見圖4。由圖4可知，制曲時間同為36 h時，加入紫蘇后的成曲中酚含量為4.02 mg GAE/g，與不加紫蘇的組相比，減少了6.9%，這可能是由于紫蘇要比黃豆含有更多的纖維素，需要米曲霉耗費更多的時間去合成分泌纖維素酶，使纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖等物質(zhì)。而隨著制曲時間的延長，成曲中總酚含量隨之急劇上升，之后的回落是由于制曲時間太長，酚類物質(zhì)有所氧化。在制曲時間為44 h時存在峰值，總酚含量為5.60mgGAE/g。故響應(yīng)面優(yōu)化試驗中將制曲時間定為40 h、44 h、48 h。

圖4 制曲時間對成曲中總酚含量的影響Fig.4 Effects of koji-making time on the content of total phenols in finished koji

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

應(yīng)用Box-Behnken原理進行響應(yīng)面試驗，選擇紫蘇粉添加量、接種量、菌種復(fù)配比和制曲時間4個因素為自變量，以成曲中總酚含量（Y）為響應(yīng)值，進行試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 制曲工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 3 Results and analysis of response surface analysis for koji making technology optimization

使用Design Expert 8.0.5b軟件，通過其中Box-Behnken Design模型處理表3數(shù)據(jù)，二次響應(yīng)面回歸擬合得到成曲中總酚含量與紫蘇粉添加量、接種量、菌種復(fù)配比和制曲時間四因素之間的回歸方程為：Y=5.63-0.17A-0.15B-0.16C-0.027D-0.18AB+0.025AC-5×10-3AD+0.14BC-7.5×10-3CD-0.68A2-0.14B2+0.034C2-0.037D2，對模型進行分差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表4。

由表4回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著（P＜0.05），失擬項不顯著，說明該模型與實際實驗擬合較好，故通過響應(yīng)面法對紫蘇曲料的制備工藝進行的優(yōu)化是合理可行的。

表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments results

根據(jù)表4中：F（A）=9.00，F(xiàn)（B）=7.23，F(xiàn)（C）=7.96，F(xiàn)（D）=0.24，說明各因素條件對成曲品質(zhì)的影響程度存在差異，按照其影響程度大小排序為紫蘇粉添加量＞菌種復(fù)配比＞接種量＞制曲時間。根據(jù)顯著性結(jié)果可知，回歸方程一次項A和平方項A2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項B和一次項C對結(jié)果影響顯著，其他因素對結(jié)果影響均不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)化與分析

通過Design Expert 8.0.5b軟件，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，作出響應(yīng)面分析圖，擬合出一系列響應(yīng)面形狀，從而分析紫蘇粉添加量、接種量、菌種復(fù)配比和制曲時間交互作用對總酚含量的影響，響應(yīng)面結(jié)果見圖5。

根據(jù)響應(yīng)面模型與回歸方程，可得出理論最優(yōu)制曲工藝條件為紫蘇粉添加量6.92%，接種量0.32%，菌種復(fù)配比1.94∶1（g∶g），制曲時間43.04h，總酚含量的理論值為6.07mgGAE/g。在考慮因素實際可操作性后，將上述最優(yōu)制曲工藝條件修改為：紫蘇粉添加量7%，接種量0.3%，菌種復(fù)配比2∶1（g∶g），制曲時間44 h。在該條件下進行平行試驗3次，測量成曲中總酚含量，取平均值，結(jié)果為6.25 mg GAE/g，相對誤差為0.5%，說明回歸方程與實際情況擬合較好。

圖5 紫蘇粉添加量、接種量、制曲時間和菌種復(fù)配比交互作用對紫蘇豆醬成曲中總酚含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between perilla powder addition,inoculum,koji-making time and compound strain ratio on the content of total phenols in finished koji

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面法，在單因素的試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken Design模型確定了紫蘇豆醬的最優(yōu)制曲工藝，其工藝條件為紫蘇粉添加量7%，接種量0.3%，米曲霉與黑曲霉配比2∶1，制曲時間44h。該條件下所制得成曲中的總酚含量為6.25 mg GAE/g，相對誤差為0.5%。利用紫蘇制備的豆醬，不僅具有明顯的紫蘇風(fēng)味，還比普通豆醬具有更多的酚類物質(zhì)，使豆醬的品質(zhì)得到提升，同時賦予豆醬特殊風(fēng)味。

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