甜高粱莖稈袋裝青貯研究

杜軍國，季 彬，祁宏山，曾 楊，陳 娟，祝 英，王治業(yè)*

（1.甘肅省科學院生物研究所，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省工業(yè)微生物工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730030）

農(nóng)業(yè)部《全國草食畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2016-2020）》中指出，2015年時我國規(guī)模以上肉牛（≥50頭）、肉羊（≥100只）飼養(yǎng)量分別占全國牛、羊飼養(yǎng)總量的27.5%、36.5%，預計至2020年時占比也僅為45%、45%。即截至目前占我國養(yǎng)殖業(yè)多數(shù)的仍為小散微養(yǎng)殖戶。由于養(yǎng)殖規(guī)模有限，小散微養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中多不愿有過多的成本投入，飼料也僅以干、黃秸稈為主，少有青、黃貯等飼料，這嚴重制約了秸稈飼料化技術在我國的推廣應用。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青貯窯的建造以及青貯前的物料集運、青貯過程中的機械化壓封等是造成秸稈青貯發(fā)酵成本過高的主因。為此，有研究人員[1-3]采用袋裝就地青貯的方法來制作秸稈飼料，該法具有一次性投資少、可階段性青貯、隨時取用等優(yōu)點[2-4]，比較適合在小散微養(yǎng)殖戶中推廣。但因我國西北地區(qū)秋冬季節(jié)環(huán)境溫度過低[5]，一般十月下旬時日最低溫度就已低至零下，由此導致袋裝青貯飼料發(fā)酵時間過長、蛋白增量不明顯等問題。

一般說來，用可低溫發(fā)酵的秸稈飼料化菌劑來制備秸稈飼料能有效解決這一問題。目前，關于低溫發(fā)酵菌劑的研究主要集中在秸稈還田[6-7]、廢水處理[8]以及沼氣產(chǎn)生[9-10]等領域。市面上，在售的秸稈飼料化菌劑種類繁多，但是否可用于在低溫下啟動以發(fā)酵制備甜高粱袋裝秸稈飼料尚不可知?；诖耍狙芯坎捎脙?yōu)化篩選的方法，從眾多市售菌劑及自制菌劑當中獲得一種可在低溫下發(fā)酵、并能顯著縮短發(fā)酵時間的秸稈飼料化菌劑，以期能在小散微養(yǎng)殖戶中推廣利用秸稈飼料化技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌劑

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸氫二胺2 g，葡萄糖20 g，吐溫80 2 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，七水合硫酸鎂0.58 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至6.2，分裝后于121℃高壓滅菌20 min；

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1000mL，氯霉素0.1g，瓊脂15g。上述各組分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液，分裝后，121℃滅菌20 min。傾注平板前，另用少量乙醇溶解氯霉素加入培養(yǎng)基中。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖（分析純）：天津市永大化學試劑開發(fā)中心；蛋白胨（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；酵母膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京Solarbio科技有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市北方化玻購銷中心；3,5-二硝基水楊酸（分析純）：上海士鋒生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、硫酸鉀（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20-FiveEasy Plus pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；海能K100型全自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；756MC型紫外可見光分光光度計：上海分析儀器總廠；超低功耗便攜式地溫采集裝置和方法：專利產(chǎn)品（專利公開號：CN104330177A）。

1.3 方法

1.3.1 甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作

標準方面，因五味子、南五味子炮制飲片規(guī)格多，并且各地方飲片標準不完善，存在無標準或有標準而無檢驗項目的情況。另外，本次在國抽樣品檢驗基礎上對五味子標準的【鑒別】項進行了探索性研究，新建立的薄層鑒別法增加了五味子醇甲和五味子乙素為指標性成分，能有效區(qū)分五味子和南五味子。建議修訂其薄層色譜鑒別項，提高五味子藥材及飲片標準鑒別項目的專屬性，從而可有效區(qū)分以南五味子冒充五味子的情況。

試驗采用隨機區(qū)組設計，對照組（CK處理）中每噸秸稈噴施1 L蒸餾水，試驗組中不同菌劑的使用量分別如下：DJ菌劑，200 g/t飼料；“畜草1號”乳酸菌劑，2.5 g/t飼料；R2J1菌劑，1 L/t飼料。甜高粱秸稈采用袋裝打包、室溫堆放方式青貯發(fā)酵45 d，每個處理打10包，每包約75 kg，發(fā)酵期間對其溫度、pH值、乳酸菌、酵母菌數(shù)、粗蛋白含量、殘?zhí)堑戎笜诉M行測定。

1.3.2 分析檢測

溫度測定：在秸稈袋裝飼料制作過程中，將專利產(chǎn)品“超低功耗便攜式地溫采集裝置”溫度探頭置于發(fā)酵袋中，發(fā)酵過程中每隔3 d在固定時間采集一次溫度。pH值測定：稱取樣品10g再加入90mL蒸餾水，在室溫條件下靜置10min，待其充分浸泡后，用實驗室pH計測定。粗蛋白含量測定：詳見國標GB50095—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》。殘?zhí)菧y定：采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicvlic acid，DNS）比色法。

乳酸菌數(shù)測定：采用MRS培養(yǎng)基，分別接種10-6、10-7、10-8、10-94個稀釋梯度的懸浮液并涂布在培養(yǎng)皿上，于37℃培養(yǎng)72 h后，選取MRS培養(yǎng)基上光滑、圓形的灰白色菌落進行乳酸菌計數(shù)。

酵母菌和霉菌數(shù)量測定：采用孟加拉紅培養(yǎng)基，分別接種10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7這7個稀釋梯度的懸浮液于（28±1）℃培養(yǎng)48 h后，選取孟加拉紅培養(yǎng)基上濕潤、光滑、不透明、比細菌大而厚的菌落進行酵母菌計數(shù)；同時選取菌絲細長、菌落疏松呈絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀、棉絮狀菌落進行霉菌計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中各處理溫度和pH值變化分析

在秸稈飼料發(fā)酵制備過程中，除了滿足一定的厭氧要求[11-12]外，還需維持菌種生長和產(chǎn)物合成所需的一定溫度[13]，這主要是因為微生物的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化作用下進行的，而溫度是影響酶活性的重要因素。以甜高粱秸稈自然青貯為對照，不同發(fā)酵菌劑（DJ農(nóng)作物秸桿生物發(fā)酵飼料菌劑、“畜草1號”乳酸菌劑及R2J1菌劑）處理甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作過程中溫度及pH的變化結(jié)果見圖1。

西北地區(qū)秋冬季節(jié)寒冷的氣候條件，是制約秸稈飼料化技術在該地小散微養(yǎng)殖戶中推廣的主要原因。由圖1A可知，在整個飼料化發(fā)酵期間，各處理溫度隨著環(huán)境溫度的下降而迅速下降，但卻始終高于環(huán)境溫度0.6～7.2℃，說明環(huán)境溫度的變化是影響青貯物料溫度變化的主要原因。試驗過程中環(huán)境溫度平均值為5.93℃；R2J1菌劑處理組平均溫度10.24℃，為各處理中最高，比環(huán)境溫度平均值高出4.3℃，增溫效果要好于其他處理；“畜草1號”乳酸菌劑處理，其平均溫度為9.12℃，高出環(huán)境溫度平均值3.19℃，增溫效果僅次R2J1菌劑處理組；各處理中自然青貯組物料溫度最低，平均為8.5℃，卻也比環(huán)境溫度高出2.57℃，表明青貯過程中的微生物活動可不同程度的抵消料溫隨著環(huán)境溫度而急劇下降的不利影響。

圖1 甜高粱莖稈自然青貯和菌劑青貯飼料化發(fā)酵中溫度(A)和pH值(B)的變化Fig.1 Changes of temperature(A)and pH(B)during natural and starter siliage fermentation of sweet sorghum straw

pH值是評價秸稈青貯飼料品質(zhì)最簡單且最重要的指標，pH值越低，酸度越大，雜菌不宜生長，飼料可以得到很好的保存，但pH值＜4.5時，一則飼喂牛羊過程中須與干黃秸稈混合使用，方可避免牛羊酸中毒[14-15]，增加了農(nóng)戶勞動量；二則在抑制雜菌的同時也會使酵母菌等不能繁殖，結(jié)果是成熟飼料單細胞蛋白增量有限，因此秸稈飼料化過程中，合理范圍的pH值才是發(fā)酵所需。本試驗從發(fā)酵第3天時開始檢測pH值，由圖1B可知：甜高粱秸稈袋裝青貯發(fā)酵過程中，各菌劑處理組的pH值介于3.75～4.47之間，顯著低于自然青貯pH值（平均pH值為5.64），而其中添加R2J1菌劑處理的pH值穩(wěn)定在4.47左右，說明R2J1菌劑處理的乳酸菌株產(chǎn)酸能力較為適中。

本試驗表明，R2J1菌劑在甜高粱袋裝青貯過程中增溫效果優(yōu)于其他菌劑，在整個發(fā)酵期的平均溫度較室溫高出4.31℃，且成熟飼料酸度也較其他處理更為適中，這對該地區(qū)小散微養(yǎng)殖戶制作袋裝秸稈飼料有益。

2.2 發(fā)酵過程中粗蛋白和殘?zhí)呛孔兓治?/h3>

以甜高粱秸稈自然青貯為對照，不同發(fā)酵菌劑（DJ農(nóng)作物秸桿生物發(fā)酵飼料菌劑、“畜草1號”乳酸菌劑及R2J1菌劑）處理甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作過程中粗蛋白及殘?zhí)呛康淖兓Y(jié)果見圖2。

由圖2A可知，各處理中物料殘?zhí)呛侩S著發(fā)酵時間延長均呈降低趨勢，其中R2J1處理降幅最大為44%，其他處理中DJ菌劑處理降幅為39.2%“，畜草1號”乳酸菌劑處理降幅為40.3%，自然青貯處理降幅為39.1%；R2J1處理殘?zhí)呛吭?～6 d時下降最為迅速，12 d以后有所降低但幅度不大，分析原因可能與環(huán)境溫度下降過快有關（見圖1A）；至發(fā)酵42 d時，DJ菌劑處理中殘?zhí)橇孔罡邽?.54%，R2J1菌劑處理中殘?zhí)呛孔钌贋?.69%。

由圖2B可知，菌劑處理組中蛋白含量在發(fā)酵過程中呈遞增態(tài)勢，但在發(fā)酵18 d后遞增幅度不大，分析原因可能與環(huán)境溫度過低致使發(fā)酵提前終止有關；自然青貯處理在第12天時粗蛋白含量為8.23%，為整個處理過程中的最高值，之后隨著發(fā)酵時間的延長略有下降，這或許與自然青貯過程中的雜菌污染有關。在整個發(fā)酵處理過程中，R2J1菌劑處理中蛋白含量在第18天時含量為9.89%，比發(fā)酵前增加了27.44%，增幅在各處理中最大。

圖2 甜高粱莖稈自然青貯和菌劑青貯中殘?zhí)?A)和粗蛋白(B)含量的變化Fig.2 Changes of residual sugar(A)and crude protein(B)contents during natural and starter siliage fermentation of sweet sorghum straw

上述實驗結(jié)果表明，R2J1菌劑處理在甜高粱秸稈袋裝青貯過程中降糖增蛋白效果優(yōu)于其他處理。

2.3 發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、霉菌數(shù)變化分析

以甜高粱秸稈自然青貯為對照，不同發(fā)酵菌劑（DJ農(nóng)作物秸桿生物發(fā)酵飼料菌劑、“畜草1號”乳酸菌劑及R2J1菌劑）處理甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作過程中乳酸菌、酵母菌及霉菌數(shù)量的變化結(jié)果見表1。

青貯發(fā)酵過程中，乳酸菌的數(shù)量與青貯品質(zhì)息息相關，已有研究[16-17]表明，乳酸菌在青貯飼料發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量有機酸、細菌素及其它抑菌物質(zhì)，可以有效抑制有害菌的生長，防治二次污染，此外，作為益生菌株，其還可提高奶牛的進食量和產(chǎn)奶量。由表1可知，在整個青貯發(fā)酵過程中，各處理中乳酸菌數(shù)均呈先增后降趨勢，分別在第10～20 d期間達到峰值，其中又以R2J1菌劑處理在第20天時含有最多的乳酸菌數(shù)，為1.2×1010個/g，之后，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌數(shù)逐漸降低，至第45天時，自然青貯中乳酸菌數(shù)已低至5.39×106個/g，而R2J1菌劑處理卻仍有高達6.96×109個/g的乳酸菌數(shù)。另外，在整個發(fā)酵過程中，DJ菌劑和“畜草1號”乳酸菌劑處理中乳酸菌數(shù)相對穩(wěn)定的維持在（1.17～10.40）×108個/g。

表1 甜高粱秸稈自然青貯與菌劑青貯發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌及霉菌數(shù)量的變化Table 1 Changes of the numbers of lactic acid bacteria,yeast and mould during natural and starter siliage fermentation of sweet sorghum straw

由表1可知，在自然青貯處理中，酵母菌和霉菌始終存在，說明自然青貯處理中乳酸菌產(chǎn)酸抑菌效果不明顯；在菌劑處理組中，在發(fā)酵15 d以前時，只有R2J1菌劑處理中能檢測到酵母菌的存在，結(jié)合圖2B結(jié)果，此時粗蛋白含量正處于快速增長期，說明單細胞蛋白合成仍在繼續(xù)，另外根據(jù)圖1結(jié)果，此時R2J1處理組的pH為4.4左右，較DJ菌劑和“畜草1號”乳酸菌劑組要高。本試驗中，自然青貯處理中，霉菌數(shù)量隨發(fā)酵時間的延長持續(xù)減少，但一直都有存在，菌劑處理組中在發(fā)酵5 d時就已不能檢測到霉菌的存在，表明青貯菌劑可顯著減少秸稈飼料化過程中的霉菌污染問題。

甜高粱莖稈含糖量高[18-19]。本實驗中，使用DJ菌劑和“畜草1號”乳酸菌劑處理的秸稈飼料，其在發(fā)酵第6天時pH值已低至4.0以下（見圖1B），由于過酸，飼料中酵母菌數(shù)在第10天時已不能檢出（見表1），而粗蛋白含量在整個試驗期也基本維持在7%～8%之間（見圖2B），這是因為乳酸菌分泌的乳酸在抑制雜菌（如霉菌）的同時也阻止了有益酵母菌的繁殖（見表1），盡管在發(fā)酵18 d以后的物料粗蛋白含量仍有小幅增加，分析認為是由于乳酸菌體蛋白增加所致。

3 結(jié)論

實驗以甜高莖稈為原料，采用自然青貯和菌劑青貯兩種方式進行，袋裝發(fā)酵，結(jié)果表明，添加菌劑青貯組在物料溫度、pH值、蛋白增量、乳酸菌數(shù)等方面優(yōu)于自然青貯組；而在3種菌劑青貯處理中，用R2J1菌劑可將發(fā)酵時間控制在18 d左右，此時飼料pH值為4.5，飼料中乳酸菌數(shù)高達1.2×1010個/g，粗蛋白含量9.89%，比發(fā)酵前增加27.44%，各項指標均優(yōu)于其他處理組，表明R2J1菌劑可用于甜高粱莖稈袋裝青貯。

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