山西老陳醋源優(yōu)良芽孢桿菌菌株的鑒定及篩選

史改玲，許 女*，賈瑞娟，李雅茹，張 浩

（山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

山西老陳醋以優(yōu)質(zhì)高梁為主要原料，大曲為發(fā)酵劑，采用傳統(tǒng)自然固體發(fā)酵并結(jié)合獨特熏、淋、曬等工藝，形成老陳醋獨特的酸、綿、香、甜風味與口感[1]。老陳醋的獨特風味得益于其天然發(fā)酵過程中微生物菌群的生長代謝及復雜的協(xié)同作用，這些微生物代謝產(chǎn)生豐富的酶類、風味、滋味及其生理功能（抗氧化、抗高血壓等）物質(zhì)[2]。如霉菌產(chǎn)生豐富的酶類分解原料，為微生物提供碳源和氮源；酵母菌不僅代謝積累大量醇類物質(zhì)，還產(chǎn)生各種醛類和酯類等風味物質(zhì)；細菌代謝產(chǎn)生大量有機酸，是老陳醋酸味主要來源[3]。

芽孢菌作為食醋釀造過程中的重要菌群，對老陳醋風味和功能成分的形成起到重要作用。大曲制作過程中，芽孢菌不僅代謝產(chǎn)生多種酶類，分解原料提供微生物的碳源和氮源，而且其代謝過程中產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，抑制大曲制作過程中病原菌的繁殖[4]。酒精發(fā)酵階段，芽孢菌與乙酸乙酯、庚酸乙酯、十二酸乙酯等多種酒醪特有風味物質(zhì)的形成密切相關[5-6]。醋酸發(fā)酵階段，芽孢菌代謝產(chǎn)生的乳酸、蘋果酸、酒石酸、丙酮酸等有機酸，一方面能緩沖乙酸帶來的強烈刺激性酸味[4]，另一方面可以與醇類物質(zhì)酯化生成酯類物質(zhì)，豐富老陳醋味感與口感。還有研究表明芽孢菌通過特定代謝途徑參與多酚、黃酮、乙偶姻等功能活性物質(zhì)的生成[7-10]。

近年來，對食醋中芽孢桿菌的特性研究有了一定進展。黃思敏等[9]從傳統(tǒng)麩醋醋醅中分離得到一株芽孢桿菌，其產(chǎn)酚和產(chǎn)黃酮能力較好，總酚和總黃酮產(chǎn)量分別為49.7μg/mL和218.1 μg/mL。陳志遠[10]考察了一株分離至傳統(tǒng)麩醋醋醅的芽孢桿菌，結(jié)果表明在最適發(fā)酵條件下，總黃酮、總酚含量分別可達241.9 μg/mL和229.8 μg/mL。于華等[11]從四川麩醋醋醅篩選出產(chǎn)酸能力較強的產(chǎn)酸芽孢桿菌（Bacillus acidiproducens）和凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）[12]，在最適產(chǎn)酸條件下，其產(chǎn)酸能力分別達到6.105 g/L和7.764 g/L。王進龍[4]從山西老陳醋大曲中分離篩選出產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌BA7、BA8及BA10和產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌BP4、BP8，并將這些芽孢桿菌應用到山西老陳醋發(fā)酵生產(chǎn)，提高了山西老陳醋總酯含量及香氣成分。

本研究主要對分離自山西老陳醋醋醅中的9株芽孢菌進行分子生物學鑒定，并對其產(chǎn)酶、產(chǎn)酸、產(chǎn)酯、產(chǎn)多酚及產(chǎn)乙偶姻等發(fā)酵特性進行綜合考察，以期對優(yōu)良菌劑的開發(fā)，強化老陳醋生產(chǎn)進而提質(zhì)增效具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 芽孢菌菌株

芽孢菌菌株（CP-18、CP-1853、CP-1671、CP-803、CP-2430、CP-6、CP-1576、CP-15、CP-2436）：均分離自山西老陳醋成熟醋醅中，保存于山西農(nóng)業(yè)大學食品學院生物工程實驗室。

1.1.2 試劑與材料

細菌DNA提取試劑盒：北京博邁德基因技術有限公司；PCR引物：由深圳華大基因公司合成；Maker D、MIX：上海生工生物工程股份有限公司；3-羥基-2-丁酮（色譜純）：美國Sigma Aldrich公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、干酪素、福林酚、肌酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（用于芽孢菌的活化及產(chǎn)酚芽孢菌的篩選）、淀粉培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉和酪蛋白培養(yǎng)基[9]（用于產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)蛋白酶芽孢菌的篩選）、產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基[11]（用于產(chǎn)酸芽孢菌的篩選）、高粱汁培養(yǎng)基[13]（用于產(chǎn)酯芽孢菌的篩選）、Voges-Proskauer（V-P）培養(yǎng)基[14]（用于產(chǎn)乙偶姻芽孢菌的篩選）：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

T100型PCR儀、Universial HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；5417R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ZWY-1102C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；BJ-CD型超凈工作臺：上海躍進醫(yī)療器械廠；722型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；PB-21型酸度計：北京賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山西老陳醋源芽孢菌菌株的形態(tài)學觀察

芽孢菌菌落形態(tài)觀察：將菌株劃線涂布于平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24 h后，觀察菌落特征。如大小、透明度、形狀、邊緣、顏色、隆起形狀等。

芽孢菌細胞形態(tài)觀察：對培養(yǎng)24 h的芽孢菌菌體進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察染色結(jié)果及細胞形態(tài)。

1.3.2 山西老陳醋源芽孢菌菌株的鑒定及進化樹構(gòu)建

芽孢菌分子生物學鑒定：依據(jù)細菌DNA提取試劑盒的方法提取9株芽孢菌基因組DNA，以此DNA為模板，利用細菌16SrDNA通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1 492R（ACGGCTACCTTGTTACGACTT）對芽孢菌16S rDNA進行擴增。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶，將回收產(chǎn)物送至武漢華大基因測序。

芽孢菌進化樹構(gòu)建：在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）搜索與目的菌株序列同源性高的序列，經(jīng)MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)酶能力測定

-80℃保藏的芽孢菌菌株活化后挑取單菌落接至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后得到芽孢菌種子液。芽孢菌種子液以5%（V/V）比例分別接種至淀粉培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，5 000 r/min離心15 min得到待測粗酶液。分別采用DNS比色法[9]測其纖維素酶活和淀粉酶活，福林-酚比色法[9]測其蛋白酶活。

1.3.4 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)酸能力測定

芽孢菌種子液以5%（V/V）比例接種于產(chǎn)酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，用NaOH滴定法[15]測定發(fā)酵液中總酸含量。

1.3.5 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)酯能力測定

芽孢菌種子液以5%（V/V）比例接種于高粱汁培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后，采用回流皂化法[16]測定發(fā)酵液中總酯含量。

1.3.6 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)多酚能力測定

芽孢菌種子液以5%（V/V）比例接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，用Folin-Ciocalteu比色法[17]測定發(fā)酵液中多酚產(chǎn)量。

1.3.7 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)乙偶姻能力測定[16]

芽孢菌種子液以5%（V/V）比例接種于V-P培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，采用肌酸比色法[14]測定發(fā)酵液中乙偶姻產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋源芽孢菌的形態(tài)學觀察

9株山西老陳醋醋醅來源的芽孢菌菌落形態(tài)及細胞形態(tài)學觀察結(jié)果分別見圖1和圖2。具體形態(tài)學描述見表1。

圖1 9株芽孢菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 9 strains ofBacillus

圖2 9株芽孢菌細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology of 9 strains ofBacillus

表1 9株芽孢菌菌落及細胞形態(tài)描述Table 1 Colony and cell morphology description of 9 strains ofBacillus

2.2 山西老陳醋源芽孢菌的鑒定結(jié)果

參照菌株的形態(tài)學觀察結(jié)果，使用NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果進行進行BLAST分析，將測得的基因序列與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖3。

圖3 9株芽孢菌基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains ofBacillusbased on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株CP-18、CP-1853和CP-1671在系統(tǒng)發(fā)育樹上與地衣芽孢桿菌同屬于一個分支，通過BLAST比對，這些菌株序列與已知的多株地衣芽孢桿菌16S rDNA的同源性最高可達93%，因此，菌株CP-18、CP-1853、CP-1671被鑒定為地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）。同理，菌株CP-2430被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）；菌株CP-6、CP-1576被鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）；菌株CP-15被鑒定為海威芽孢桿菌（B.mojavensis）；CP-2436被鑒定為球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）。

2.3 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)酶特性研究

山西老陳醋釀造過程中的酶主要來源于大曲。大曲是整個發(fā)酵過程中的糖化劑和發(fā)酵劑，其含有多種微生物，包括霉菌、細菌、酵母菌等，這些微生物代謝產(chǎn)生豐富的酶類，促進淀粉、纖維素和蛋白質(zhì)的充分利用，提高原料利用率。研究表明，釀醋大曲中的芽孢桿菌代謝可產(chǎn)生多種酶，不僅為微生物代謝提供豐富底物，還可將釀醋原料中的蛋白質(zhì)水解成各種氨基酸，提高食醋的鮮味[4]。

對9株芽孢菌發(fā)酵液中的淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶酶活分別進行測定，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，9株芽孢菌的淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶活分別在9.77～61.40 U/mL、7.98～54.99 U/mL、4.16～22.80 U/mL范圍內(nèi)。其中，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）CP-1576發(fā)酵液淀粉酶活力最高（61.40 U/mL），球形賴氨酸芽孢桿菌（Ly.sphaericus）CP-2436發(fā)酵液中纖維素酶活力最高（54.99U/mL），地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）CP-1853的發(fā)酵液蛋白酶活力達到最高為22.80 U/mL，且其淀粉酶和纖維素酶酶活也相對較高，分別為43.22 U/mL、38.97 U/mL。相較于王進龍[4]從山西老陳醋大曲中分離篩選的高產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的芽孢桿菌BA8和BP4，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）CP-1853淀粉酶酶活（43.22U/mL）高于BA8粗酶液酶活（41.01U/mL），但是其蛋白酶酶活（38.97 U/mL）低于BP4（700.19 U/mL）。

圖4 芽孢桿菌粗酶液淀粉酶、纖維素酶及蛋白酶酶活測定結(jié)果Fig.4 Determination results of amylase,cellulase and protease activity ofBacilluscrude enzyme

2.4 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)酸特性研究

山西老陳醋釀造過程中產(chǎn)生的有機酸是醋體主要酸味來源，這些有機酸主要是由發(fā)酵過程中存在的酵母菌、醋酸菌、芽孢桿菌、乳酸菌等多種微生物代謝產(chǎn)成。有研究表明，芽孢菌通過三羧酸或丙酮酸循環(huán)代謝產(chǎn)生的乳酸、丙酮酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸[18]，一方面能夠緩沖乙酸帶來的強烈刺激性酸味，賦予老陳醋酸味柔和、口感綿長的特點[4]，另一方面有機酸與醇類物質(zhì)酯化生成酯類物質(zhì)，提高香氣物質(zhì)含量、使得老陳醋味感醇厚豐富。

9株芽孢菌培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵液中總酸含量測定結(jié)果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵液中總酸含量在0.07～0.25 g/L范圍內(nèi)，其中地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）CP-18產(chǎn)酸能力最強，為0.25 g/L，但其產(chǎn)酸能力遠低于于華等[11]從四川麩醋醋醅篩選出的產(chǎn)酸芽孢桿菌（B.acidiproducens）（6.105g/L）和凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）[12]（7.764 g/L）。

圖5 芽孢桿菌的總酸產(chǎn)量測定結(jié)果Fig.5 Determination results of total acids produced byBacillusstrains

2.5 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)酯特性研究

研究表明，芽孢菌與酯類物質(zhì)的形成密切相關，牟穰[5]對清爽型黃酒釀造微生物群落與風味物質(zhì)相關性研究發(fā)現(xiàn)，庚酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯等風味物質(zhì)的產(chǎn)生與芽孢菌有極強的關聯(lián)性；而且趙長青等[6]從濃香型白酒大曲及酒醅中篩得一株高產(chǎn)己酸乙酯的蠟質(zhì)芽孢桿菌（B.cereus）YB-16。

圖6 芽孢桿菌的總酯產(chǎn)量測定結(jié)果Fig.6 Determination results of total esters produced byBacillusstrains

9株芽孢菌在高粱汁培養(yǎng)基中發(fā)酵7 d后，其發(fā)酵液中總酯含量測定結(jié)果見圖6。由圖6可知，芽孢菌發(fā)酵液總酯含量在7.08～10.67 g/100 mL，其中地衣芽孢桿菌（B.licheniormis）CP-1853產(chǎn)酯含量最高，為10.67 g/100 mL。

2.6 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)多酚特性研究

山西老陳醋中含有許多對人體有益的活性物質(zhì)，其中多酚是主要的抗氧化活性成分[18]。高粱皮細胞壁基質(zhì)中含有多種天然多酚類物質(zhì)，包括單寧、源阿魏酸、兒茶素、花色苷、香豆酸、白藜蘆醇等，在酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段，微生物分泌的各種功能性酶分解植物細胞壁從而釋放這些酚類物質(zhì)[2]。也有報道表明，食醋釀造過程中微生物的代謝活動也會產(chǎn)生酚類物質(zhì)[9-10]。多酚類物質(zhì)除了其抗氧化功能外，還具有強化血管壁、促進腸胃消化、降低血脂肪、抑制細菌與癌細胞生長等多種生理活性功能[19-20]。

9株芽孢菌總酚含量測定結(jié)果見圖7。由圖7可知，9株芽孢菌總酚含量在144.95～596.38μg/mL范圍內(nèi)，其中，枯草芽孢桿菌（B.subtilis）CP-803的總酚含量高達596.38 μg/mL，高于黃思敏等[9]從四川麩醋醋醅中分離的一株芽孢菌總酚含量（49.70 mg/mL）和于華等[11]從四川麩醋醋醅中分離的一株芽孢菌總酚含量（263.60 μg/mL）。

圖7 芽孢桿菌的多酚產(chǎn)量測定結(jié)果Fig.7 Determination results of total polyphenols produced by Bacillusstrains

2.7 山西老陳醋源芽孢菌產(chǎn)乙偶姻特性研究

山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段，微生物利用乙醇和葡萄糖為底物，通過雙乙酰/乙偶姻的代謝途徑合成乙偶姻（acetoin，ACT）。乙偶姻不僅是老陳醋重要的風味物質(zhì)，而且是老陳醋重要呈味及功能物質(zhì)川芎嗪生物合成的前體。有報道稱川芎嗪具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血脂等生理活性功能[21]。目前關于芽孢菌產(chǎn)乙偶姻的研究在酒曲和白酒中較多。王霜等[22]從兼香型白酒酒醅中篩選到兩株產(chǎn)乙偶姻的地衣芽孢桿菌LS9和枯草芽孢桿菌S10，其在小麥固體培養(yǎng)基中乙偶姻產(chǎn)量分別為6.52 mg/mL和4.13 mg/mL。郝飛等[7]篩得一株茅臺中溫度大曲源枯草芽孢桿菌CCTCCM 208157，進行pH條件優(yōu)化后，其發(fā)酵罐水平上乙偶姻產(chǎn)量為32.7 mg/mL。

關于醋源產(chǎn)乙偶姻的菌株多為醋酸菌和乳酸菌，趙洪源等[14]從四川涼州熏醋醋醅中篩得一株高產(chǎn)乙偶姻的巴氏醋桿菌C92并優(yōu)化其發(fā)酵條件，最終在最適條件下，該菌株乙偶姻高達19.04 g/L。吳林寰[23]通過元基因組學從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選得到3株高產(chǎn)乙偶姻的醋酸菌和2株乙偶姻的乳酸菌，并將這些醋酸菌與乳酸菌互作研究其產(chǎn)乙偶姻特性，結(jié)果表明，兩種微生物共培養(yǎng)后乙偶姻的產(chǎn)量明顯高于乳酸桿菌純培養(yǎng)后的乙偶姻產(chǎn)量。LU Z M等[21]進一步闡明了鎮(zhèn)江香醋醋醅源乳酸菌通過雙乙酰/乙偶姻的代謝途徑產(chǎn)乙偶姻的代謝機制。

對9株芽孢菌發(fā)酵液乙偶姻含量測定結(jié)果見圖8。由圖8可知，9株芽孢菌發(fā)酵液乙偶姻含量在0.13～1.15 mg/mL之間，其中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）CP-1576的乙偶姻產(chǎn)量最高，為1.15 mg/mL。

圖8 芽孢桿菌的乙偶姻產(chǎn)量測定結(jié)果Fig.8 Determination results of acetoin produced byBacillusstrains

3 結(jié)論

山西老陳醋釀造過程是多種微生物協(xié)同作用的復雜微生態(tài)體系，對其中的微生物生產(chǎn)特性進行研究，有助于了解菌株特性，定向指導生產(chǎn)。本課題對山西老陳醋來源的9株芽孢菌進行分子生物學鑒定，并對其產(chǎn)酶、產(chǎn)酸、產(chǎn)酯、產(chǎn)多酚及產(chǎn)乙偶姻特性初步研究，結(jié)果表明，9株芽孢菌中CP-18、CP-1853、CP-1671被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），CP-803為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），CP-2430為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），CP-6、CP-1576為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus），CP-15為漠海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis），CP-2436為球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussphaericus）。特性研究結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌CP-1853的蛋白酶活最高（22.80U/mL），且具有較高的產(chǎn)淀粉酶（43.22U/mL）和纖維素酶（38.97U/mL）能力；地衣芽孢桿菌CP-18具有較強的產(chǎn)酸能力（0.25 g/L）；地衣芽孢桿菌CP-1853具有較強的產(chǎn)酯能力（10.67g/100mL）；產(chǎn)多酚能力和產(chǎn)乙偶姻能力最強的菌株分別為枯草芽孢桿菌CP-803（596.38μg/mL）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌CP-1576（1.15mg/mL）。這些芽孢菌作為潛在的生產(chǎn)菌株，為山西老陳醋源優(yōu)良生產(chǎn)菌劑的開發(fā)和產(chǎn)品提質(zhì)增效提供一定的資料。

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