樹蘭組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

甘春雁　沈麗娟　韋妙琴　曾進(jìn)　蘇大宏　歐振飛

摘要 從外植體的選擇、培養(yǎng)基、植物激素、其他添加物和培養(yǎng)條件等方面概述近幾年國內(nèi)樹蘭組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展，分析樹蘭組織培養(yǎng)過程中存在的問題，并提出相關(guān)建議與展望，為今后樹蘭的快速繁育及種質(zhì)資源保存研究提供參考。

關(guān)鍵詞 樹蘭 ；組織培養(yǎng)；外植體

中圖分類號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）13-0033-03

Research Advances in Tissue Culture of Epidendrum

GAN Chunyan，SHEN Lijuan，WEI Miaoqin et al

（Nanning Qingxiu Mountain Tourism Development Co.，Ltd.， Nanning，Guangxi 530029）

Abstract Research advances in tissue culture of Epidendrum at home in recent years were mainly reviewed from the aspects of the selection of explants，culture medium，plant hormone，other additives and culture condition.The exist problems in the tissue culture of Epidendrum were analyzed，then some proposals and prospect of Epidendrum were put forward，which provided for further study in rapid breeding and germplasm conservation of Epidendrum.

Key words Epidendrum；Tissue culture；Explants

樹蘭（Epidendrum）又名柱瓣蘭，為蘭科樹蘭屬植物的統(tǒng)稱，屬瀕危蘭花物種，原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)的厄瓜多爾，從佛羅里達(dá)到阿根廷北部地區(qū)均有廣泛分布[1]。因其具有較大的花序，花色豐富艷麗，花期較長，整體觀賞效果很好，深受蘭花愛好者的喜愛，是一種具有極高觀賞價(jià)值的熱帶蘭花[2]。在國外經(jīng)過多年屬內(nèi)種間或品種間的雜交育種，已培育出大量比樹蘭原生種更具高觀賞效果的優(yōu)良品種，并已投入商業(yè)化生產(chǎn)[3]。樹蘭在熱帶和亞熱帶地區(qū)常作為切花或盆花栽培生產(chǎn)；在溫帶地區(qū)常被應(yīng)用于溫室盆花栽培或園林地被栽培[4]。

在我國，關(guān)于樹蘭的栽培繁育技術(shù)仍未成熟，且由于樹蘭珍貴、數(shù)量稀少，市場上并不常見。傳統(tǒng)的樹蘭繁殖方式有扦插繁殖、分株繁殖及無菌播種繁殖。但長期的扦插繁殖和分株繁殖速度太慢，易受病毒病危害，導(dǎo)致品質(zhì)退化，不利于樹蘭的推廣生產(chǎn)。用無菌播種誘導(dǎo)形成原球莖進(jìn)行繁殖，繁育后代易發(fā)生變異，不利于親本形狀的保持[5]。隨著先進(jìn)生物技術(shù)的推廣和運(yùn)用，組織培養(yǎng)技術(shù)已被應(yīng)用于大量蘭花品種的繁育[6-12]，且在國內(nèi)采用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)樹蘭進(jìn)行快速繁殖已有少量成功報(bào)道。筆者從外植體的選擇、培養(yǎng)基、植物激素、其他添加物及培養(yǎng)條件等方面概述近幾年對(duì)樹蘭原球莖的誘導(dǎo)、增殖以及分化影響的研究進(jìn)展，分析樹蘭組織培養(yǎng)過程中存在的問題，并提出相應(yīng)建議與展望，旨在為今后樹蘭的快速繁育及種質(zhì)資源保存提供理論依據(jù)。

1 種質(zhì)資源

樹蘭屬是蘭科中較大的屬，有1 000多個(gè)原生種[1]。樹蘭屬在蘭科植物中是一個(gè)親和力較強(qiáng)的屬，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，到1997年已經(jīng)與鈍口蘭屬（Amblostoma）、巴克蘭屬（Barkeria）、布勞頓蘭屬（Broughtonia）、白拉索蘭屬（Brassavola）等17個(gè)屬雜交產(chǎn)生2～6個(gè)屬間的人工屬至少45個(gè)。截至2012年，該屬以母本做雜交的種約606個(gè)，以父本做雜交的種約673個(gè)[4，13]。目前，樹蘭屬常見種或品種有美花樹蘭（Epi.Calanthum）、緣毛樹蘭（Epi.ciliare）、棒葉樹蘭（Epi.Corifolium）、異形樹蘭（Epi.Difforme）、多花樹蘭（Epi.Floribundum）、蘆莖樹蘭（Epi.ibaguense）、夜香樹蘭（Epi.nocturnum）、帕克森樹蘭（Epi.parkinsonianum）、叢生樹蘭（Epi.polyanthum）、假樹蘭（Epi.Pseudepdendrum）、兔唇樹蘭（Epi.centropetalum）、膠水樹蘭（Epi.ciliare）等[3]。隨著人們生活水平的不斷提高，花卉將成為人們精神生活的重要調(diào)節(jié)劑，對(duì)花卉的需求量將越來越大。為豐富國內(nèi)外花卉市場、促進(jìn)蘭花產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，保護(hù)瀕危物種資源，搜集、引進(jìn)樹蘭屬種質(zhì)資源以及培育新種具有重要的意義和深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值。

2 組織培養(yǎng)技術(shù)

2.1 組織培養(yǎng)程序

樹蘭的組織培養(yǎng)程序與其他蘭花的程序相似，包括外植體的選擇和消毒、誘導(dǎo)形成原球莖、原球莖繼代增殖、分化成苗、生根壯苗的培養(yǎng)、出瓶移栽培養(yǎng)、室外栽培7個(gè)階段[14]。

2.2 外植體的選擇

外植體是植物組織培養(yǎng)中原球莖的重要來源[14]。在樹蘭的組織培養(yǎng)中，常以種子、莖尖、莖段、叢芽、側(cè)芽、幼芽、花梗等為外植體（表1）。在樹蘭組織培養(yǎng)研究中，在外植體的選擇上，谷祝平等[5]以成熟的種子作為外植體；曾宋君[1]以種子、莖尖為外植體；魏翠華[2]以樹蘭莖尖、側(cè)芽為外植體；張建霞等[15]以膠水樹蘭的幼芽為外植體；潘雪峰等[16]采用成熟度7～8成、未開裂的樹蘭蒴果的未成熟種子作為外植體；孫瑤等[17]以樹蘭無菌苗的莖段和叢芽作為外植體；王澤祺等[18]以樹蘭莖段為外植體；周亞倩[19]以樹蘭種子為外植體；易雙雙等[20]以樹蘭當(dāng)年生分蘗苗的帶芽莖段為外植體；李春華等[3]以種子為外植體，均分別成功誘導(dǎo)出樹蘭的原球莖，為下一步的組織培養(yǎng)試驗(yàn)提供關(guān)鍵材料。

2.3 培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的核心技術(shù)，是組織培養(yǎng)中植物組織離體材料賴以生存和發(fā)展的必要營養(yǎng)基地[21]。樹蘭組織培養(yǎng)采用的基本培養(yǎng)基包括MS、1/2MS、N6、改良的VW培養(yǎng)基等。

5幼芽、側(cè)芽、叢芽頂端分生區(qū)細(xì)胞的分裂能力強(qiáng)，易于誘導(dǎo)出原球莖損傷母株誘導(dǎo)原球莖谷祝平等[5]以樹蘭的成熟種子在改良的VW培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出原球莖。曾宋君[1]對(duì)樹蘭的胚培養(yǎng)和莖尖培養(yǎng)進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為N6，在樹蘭的莖尖培養(yǎng)中以MS培養(yǎng)基的效果較好。魏翠華[2]以改良的VW培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基進(jìn)行樹蘭離體培養(yǎng)和植株再生研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原球莖轉(zhuǎn)入 VW+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基中可大量增殖并分化成小苗，小苗在 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+ 蛋白胨 3 g/L 培養(yǎng)基中壯苗與生根，生根率達(dá) 100%。張建霞等[15]以1/2MS培養(yǎng)基作為愈傷組織誘導(dǎo)、原球莖增殖、原球莖誘導(dǎo)叢生芽、幼苗增殖、壯苗及生根等的基本培養(yǎng)基。潘雪峰等[16]以樹蘭未成熟種子為外植體，研究原球莖的誘導(dǎo)、增殖、萌芽及生根培養(yǎng)等關(guān)鍵步驟的培養(yǎng)基配方，結(jié)果表明，樹蘭種子播種在 MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L+蔗糖 25 g/L培養(yǎng)基上，25 d 左右即可見原球莖團(tuán)；1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L+蔗糖 20 g/L+CH 2.0 g/L培養(yǎng)基對(duì)原球莖增殖的效果最佳，增殖倍數(shù)超過 9 倍；將原球莖轉(zhuǎn)入 1 /2MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖 25 g/L培養(yǎng)基上，原球莖的出芽率超過 90%； 將芽接種在1 /2MS+NAA 0.5 mg/L+BA 0.1 mg/L+香蕉泥 70 g/L+蔗糖 25 g/L的生根培養(yǎng)基中，生根率達(dá) 94%。孫瑤等[17]研究表明，樹蘭的誘導(dǎo)、分化和生根可以使用同一種培養(yǎng)基，即1/2MS+瓊脂粉8 g/L+活性炭30 g/L+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L。王澤祺等[18]以樹蘭莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以1/2MS+NAA 10 mg/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖25 g/L培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)效果最佳，生根率達(dá)93.06%。周亞倩[19]對(duì)樹蘭的組織培養(yǎng)基誘變效應(yīng)進(jìn)行研究，篩選出1/2MS為適宜誘導(dǎo)種子萌發(fā)的基本培養(yǎng)基。易雙雙等[20]以樹蘭當(dāng)年生分蘗苗的帶芽莖段為外植體在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行組織培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樹蘭莖段叢生芽誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基為MS+ NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率最高達(dá)73.13%；增殖最適宜培養(yǎng)基為MS+ NAA 1.0 mg/L+6-BA 3.0 mg/L，增殖系數(shù)最高達(dá)52；生根最適宜培養(yǎng)基為MS+ NAA 1.0 mg/L+IBA 1.5 mg/L，生根率可達(dá)100%。

2.4 植物激素

植物激素對(duì)植物離體培養(yǎng)中細(xì)胞生長、器官和組織的分化發(fā)育、形態(tài)建成起著重要的調(diào)節(jié)作用，在誘導(dǎo)愈傷組織、胚狀體或芽、根等器官，分化形成小植株的過程中必不可少。不同分化過程的培養(yǎng)基中添加的植物激素種類、用量及配比均不同，且激素對(duì)外植體誘導(dǎo)和原球莖增殖與分化起著主導(dǎo)作用[14]。樹蘭組織培養(yǎng)中常采用的激素有NAA、IBA、6-BA、2，4-D等。

谷祝平等[5]將采用種子誘導(dǎo)出的原球莖切割成小塊，放入添加2，4-D 0.2 mg/L和6-BA 0.2 mg/L的VW液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩液體培養(yǎng)，獲得了大量原球莖。曾宋君[1]在樹蘭繼代培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基中加入6-BA 0.5 mg/L效果較好，在生根培養(yǎng)時(shí)以1/2MS培養(yǎng)基加入NAA 02 mg/L和10%香蕉時(shí)效果最好。孫瑤等[17]以樹蘭無菌苗為材料，探討不同激素NAA、6-BA配比對(duì)原球莖誘導(dǎo)、芽分化和生根的影響，結(jié)果表明，不同激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化的影響差異顯著，其中以NAA 1.0 mg/L+6-BA 3.0 mg/L的激素組合誘導(dǎo)出的莖段愈傷組織最好，誘導(dǎo)率達(dá)500%；以NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L的激素濃度配比誘導(dǎo)出的芽最多，誘導(dǎo)率達(dá)52%。王澤祺等[18]采用正交試驗(yàn)研究NAA、IBA、6-BA對(duì)樹蘭愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽增殖及生根培養(yǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L +6-BA 0.4 mg/L的激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)24.44%；以NAA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L +6-BA 0.2 mg/L的激素配比對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率最高達(dá)80%。其中，NAA濃度對(duì)樹蘭莖段愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽增殖倍率的影響最大，IBA、6-BA濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響相差不大；6-BA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)率的影響最大，其次是IBA，NAA濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)率的影響最小。易雙雙等[20]研究不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA和IBA激素組合對(duì)樹蘭莖段叢生芽誘導(dǎo)、增殖及生根均有顯著影響。

2.5 其他添加物

在培養(yǎng)基中添加蔗糖、瓊脂、活性炭、香蕉汁、蘋果汁、椰子汁、水解酪蛋白、抑菌物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)等，對(duì)誘導(dǎo)、增殖、生根等均有較好的調(diào)節(jié)、清除有毒物質(zhì)、殺菌消毒、促進(jìn)生長等作用[23-29]。曾宋君[1]在基本培養(yǎng)基中加入10%椰子汁能提高萌發(fā)率和成苗率，加入綠豆芽汁能促進(jìn)胚的萌發(fā)，加入香蕉汁、蘋果汁和胡蘿卜汁能促進(jìn)成苗，加入1%活性炭有利于根的形成。潘雪峰等[16]研究不同蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)樹蘭原球莖增殖的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)基中不加蔗糖或過高的蔗糖濃度都會(huì)抑制樹蘭原球莖的增殖，較適宜樹蘭原球莖增殖的蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L。

2.6 培養(yǎng)條件

在組織培養(yǎng)過程中，溫度、光照、pH等環(huán)境條件對(duì)培養(yǎng)物的生長有很大影響。研究表明，樹蘭組織培養(yǎng)較為適宜的條件：光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12～14 h/d，培養(yǎng)溫度（24±2）℃，pH 5.8～6.0[17-19]。

3 展望

近年來，雖然國內(nèi)在樹蘭組織培養(yǎng)研究方面取得一定的進(jìn)展，但樹蘭組織培養(yǎng)快繁技術(shù)仍處于未成熟的階段，在組織培養(yǎng)過程中存在一些問題仍需繼續(xù)探討及完善：①與國外相比，國內(nèi)樹蘭種質(zhì)資源較少，因此對(duì)樹蘭品種資源的引進(jìn)、搜集、篩選及雜交育種等仍是一項(xiàng)艱巨的工作。②外植體的選擇是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。不同樹蘭品種以及不同器官部位均存在一定的分化能力差異，培養(yǎng)的難易程度也有很大區(qū)別。目前，樹蘭的離體培養(yǎng)大多選擇種子、莖尖、莖段、叢芽、側(cè)芽、幼芽、花梗等為外植體，而尚未見以對(duì)母株無傷害、不受季節(jié)限制且數(shù)量較多的葉片和根尖[30]作為外植體進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道。因此，葉片和根尖是否為樹蘭組織培養(yǎng)中優(yōu)良的外植體材料仍有待研究。③外植體的消毒是離體培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。截至目前，國內(nèi)對(duì)樹蘭外植體消毒方法的研究極少，外植體的表面消毒處理技術(shù)仍是未來研究的難點(diǎn)之一。④建立樹蘭組織培養(yǎng)快繁體系是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。因此，對(duì)樹蘭優(yōu)良品種的引進(jìn)、篩選，組培快繁中外植體誘導(dǎo)萌發(fā)、叢生芽形成、增殖分化、生根壯苗培養(yǎng)等各個(gè)階段，以及外植體的來源、培養(yǎng)基的篩選、外源激素、添加物和培養(yǎng)條件等方面的探索仍是今后主要研究內(nèi)容，以期為建立健全、高效、標(biāo)準(zhǔn)化的樹蘭組培快繁技術(shù)體系奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)，更快更好地實(shí)現(xiàn)樹蘭優(yōu)良品種的工廠化生產(chǎn)，從而滿足市場需求。

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