不同消毒處理及保存時(shí)間對(duì)蝴蝶蘭外植體脫毒效果的影響

宋火元

（深圳園林股份有限公司，廣東深圳 518000）

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）隸屬于蘭科蝴蝶蘭屬，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，因其株形優(yōu)雅，花色艷麗，受到廣大市民的喜愛(ài)，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。

蝴蝶蘭為氣生蘭，自然條件下存在種子萌發(fā)率低、形狀分離嚴(yán)重等問(wèn)題[4，5]，因此蝴蝶蘭擴(kuò)繁主要采取植物組織培養(yǎng)的方式，既能保證蝴蝶蘭種質(zhì)性狀的穩(wěn)定，又能實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。在植物組織培養(yǎng)所要求的無(wú)菌生長(zhǎng)環(huán)境下，外植體脫毒效果的好與壞關(guān)系到整個(gè)蝴蝶蘭種苗擴(kuò)繁的生產(chǎn)及后續(xù)種苗的品質(zhì)。

春節(jié)過(guò)后，蝴蝶蘭苗場(chǎng)會(huì)在節(jié)后一次性剪掉未售出的開(kāi)花株的花梗，組培室可以以較低的成本獲得蝴蝶蘭組織培養(yǎng)擴(kuò)繁所需的外植體。往往一次性剪下的蝴蝶蘭花梗數(shù)量較大，如果組培室的生產(chǎn)錯(cuò)過(guò)了花梗的最佳接種時(shí)期會(huì)浪費(fèi)大量的人力物力，合理地安排好接種擴(kuò)繁工作可以更好地控制生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品產(chǎn)出。以6 個(gè)蝴蝶蘭品種的外植體為研究對(duì)象，研究外植體獲取時(shí)間和接種時(shí)間間隔（即保存時(shí)間）以及升汞消毒時(shí)間對(duì)外植體脫毒效果的影響，以期為蝴蝶蘭擴(kuò)繁產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料獲取

本試驗(yàn)選取了6 個(gè)不同品種的蝴蝶蘭（表1），在同一時(shí)間內(nèi)分別剪下其開(kāi)花的花梗放入無(wú)菌蒸餾水中，選擇生長(zhǎng)健壯、無(wú)變異、無(wú)損傷的花梗，剪成約6～8cm 的長(zhǎng)度以獲取外植體，保證外植體上切口為直角平切、切口平滑。每個(gè)外植體保留1 個(gè)飽滿、有活力的芽點(diǎn)，除去覆蓋在芽點(diǎn)上的薄衣。用75%醫(yī)用酒精棉對(duì)每個(gè)外植體進(jìn)行擦拭干凈后，將花梗末端放入深2cm 的無(wú)菌蒸餾水中，每天更換無(wú)菌蒸餾水直至整個(gè)組培生產(chǎn)過(guò)程的完成。

表1 本研究使用的蝴蝶蘭品種

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用隨機(jī)單因素設(shè)計(jì)，每個(gè)處理選取不同的蝴蝶蘭品種外植體各5 個(gè)，共30 個(gè)，設(shè)3 次重復(fù)。試驗(yàn)分為7 個(gè)步驟：（1）將外植體放入細(xì)口燒瓶中，每瓶10個(gè)，加入75%的醫(yī)用酒精，搖動(dòng)燒瓶30s，倒掉酒精，用無(wú)菌蒸餾水沖洗5 次；（2）第1 次倒入0.1%升汞，不間斷搖動(dòng)燒瓶；（3）倒掉升汞，用無(wú)菌蒸餾水沖洗8 次，取出外植體，切掉兩端約0.5cm，重新放入燒瓶中；（4）第2 次倒入0.1%升汞，不間斷搖動(dòng)燒瓶；（5）倒掉升汞，用無(wú)菌蒸餾水沖洗10 次，取出外植體，切掉兩端約0.5cm后將外植體放入培養(yǎng)基中；（6）每瓶培養(yǎng)基放入1 個(gè)外植體，外植體長(zhǎng)度為5cm 左右，深度以芽點(diǎn)不能沒(méi)入培養(yǎng)基；（7）將培養(yǎng)基放入封閉無(wú)菌環(huán)境的培養(yǎng)室中，溫度控制在20～25℃之間，光照時(shí)間為10h，光照強(qiáng)度為1600Lx。

每個(gè)處理均使用同一批次生產(chǎn)的蝴蝶蘭擴(kuò)繁培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為：MS+6-BA 6mg/L+NAA 2mg/L+ 椰汁20mL/L+牛肉蛋白胨5g/L。

1.2.1 不同外植體消毒處理設(shè)置。對(duì)升汞消毒時(shí)間設(shè)置了5 個(gè)梯度，即5 個(gè)處理，分別為：處理Ⅰ第1 次升汞消毒6min，第2 次升汞消毒8min；處理Ⅱ第1 次升汞消毒7min，第2 次升汞消毒9min；處理Ⅲ第1 次升汞消毒8min，第2 次升汞消毒10 min；處理Ⅳ第1 次升汞消毒9 min，第2 次升汞消毒11min；處理Ⅴ第1 次氯化汞消毒10min，第2 次升汞消毒12min。

1.2.2 不同外植體保存時(shí)間設(shè)置。將外植體保存時(shí)間設(shè)置7 個(gè)梯度，分別為保存時(shí)間為1d、2d、3d、4d、5d、6d、和7d。

1.2.3 后期管理。接入培養(yǎng)基后每天進(jìn)行觀測(cè)，半個(gè)月后結(jié)束試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)蝴蝶蘭外植體脫毒效果的影響

不同消毒處理的蝴蝶蘭外植體污染率如表2 所示?？梢钥吹?，在選取的蝴蝶蘭外植體保存時(shí)間一致的情況下，外植體污染率隨升汞消毒時(shí)間的增加呈逐漸下降的趨勢(shì)，使用升汞消毒時(shí)間越長(zhǎng)污染率越低；外植體成活率隨升汞消毒時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在消毒時(shí)間為16min 時(shí)成活率最高，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到22min 時(shí)，外植體成活率降為0%。綜合來(lái)說(shuō)，使用升汞消毒16min 時(shí)效果最佳，在保持較低污染率的同時(shí)有著較高的成活率。

2.2 蝴蝶蘭外植體保存時(shí)間對(duì)脫毒效果的影響

蝴蝶蘭外植體保存時(shí)間對(duì)脫毒效果的影響如表2所示?？梢钥吹剑谕幌緯r(shí)間處理下，蝴蝶蘭外植體即保存時(shí)間越長(zhǎng)污染率越高，外植體現(xiàn)取現(xiàn)用（1d內(nèi)）時(shí)污染率為0，保存時(shí)間超過(guò)1d 后外植體開(kāi)始出現(xiàn)污染，保存時(shí)間超過(guò)5d 后使用升汞已無(wú)法將其完全消毒，當(dāng)保存時(shí)間超過(guò)7d 污染率達(dá)到100%。同時(shí)，外植體保存時(shí)間越長(zhǎng)其成活率也越低，在保存時(shí)間不超過(guò)2d 時(shí)外植體有較高的成活率，當(dāng)外植體保存超過(guò)6d 再植入培養(yǎng)基已無(wú)法成活。綜合來(lái)說(shuō)，組織培養(yǎng)使用現(xiàn)取的外植體可獲得最佳的效果。

表2 不同消毒處理方法及保存時(shí)間對(duì)蝴蝶蘭外植體脫毒效果的影響

3 討論與結(jié)論

外植體的帶菌狀況對(duì)組織培養(yǎng)的成敗有著重要的影響，影響培養(yǎng)物的建立和生長(zhǎng)[6]，因此對(duì)外植體采取有效的消毒處理措施是組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵步驟[7]。酒精和升汞可以使蛋白質(zhì)脫水變性達(dá)到消毒效果，是植物組織培養(yǎng)中常用的消毒試劑[8]。但是酒精和升汞處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生一定傷害，甚至使外植體失活，影響組織培養(yǎng)的效果，因此選取合適的消毒處理方法至關(guān)重要。本研究表明，0.1%升汞對(duì)蝴蝶蘭外植體有明顯的消毒效果，但是處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后升汞殘留較多，其毒性影響了外植體的生長(zhǎng)，在消毒時(shí)間超過(guò)22min時(shí)外植體甚至完全失活。因此在通常情況下使用升汞消毒時(shí)需將時(shí)間嚴(yán)格控制在16min，具體時(shí)間控制還需根據(jù)外植體的大小、類別、取樣時(shí)間等進(jìn)行調(diào)整[9]。

蝴蝶蘭外植體的保存時(shí)間長(zhǎng)短也是外植體擴(kuò)繁成功的關(guān)鍵因素，保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)外植體的污染率逐漸上升，成活率顯著下降，降低了工作效率，增加了投入成本，減少了產(chǎn)品產(chǎn)出。因此在用蝴蝶蘭花梗做外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)擴(kuò)繁時(shí)應(yīng)合理安排時(shí)間，外植體應(yīng)在剪取2d 內(nèi)完成接種，最好做到現(xiàn)取現(xiàn)用。