外植體差異對(duì)植物組培苗無性快繁的影響

曹璐瑤 李晶宋來慶王書君杜曉云*

（1煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264010；2山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái) 265500）

植物組培技術(shù)在商業(yè)市場(chǎng)上用于高效率且快速地繁殖植物或培育新的植物。該技術(shù)適用于各種經(jīng)濟(jì)植物或觀賞植物，以及其它植物的微繁殖[1]。植物組培技術(shù)相對(duì)于種子育種可以更好地保留母本的優(yōu)良性狀，縮短育種年限，還可以通過超低溫保存的植物組織，對(duì)稀有植物實(shí)現(xiàn)再生利用[2]。同時(shí)，也廣泛應(yīng)用到果樹脫毒苗培育、轉(zhuǎn)基因育種等多項(xiàng)農(nóng)業(yè)技術(shù)中，因此大力發(fā)展植物組織培養(yǎng)意義重大。能否成功地進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，外植體的選擇、植物品種以及外植體不同，增殖系數(shù)存在較大差異[3]。本文分析總結(jié)了不同外植體的差異性對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響，可為植物組培工作以及實(shí)驗(yàn)研究提供相關(guān)參考和借鑒。

1 植物的組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)是人為地在滅菌的環(huán)境中，以細(xì)胞的全能性為原理，通過植物的葉片、根尖、莖等植物器官或植物組織，在適宜的環(huán)境下，離體培養(yǎng)培育出新的愈傷組織，再進(jìn)行生根培養(yǎng)，從而發(fā)育成完整的植株[4]。

1.1 外植體的分類

植物在進(jìn)行無性組織培養(yǎng)時(shí)，通常是選取植物的某些外植體進(jìn)行無性快繁培養(yǎng)，如植物的葉片、胚、種子、莖段、根尖等來進(jìn)行誘導(dǎo)分化。禾本科水稻類的作物常使用成熟胚和幼穗作為外植體，玉米常用幼胚和成熟胚，而小麥常使用的是幼穗和幼胚[5]。喬木類植物多使用莖段或嫩葉作外植體，且效果較好。在杜仲的組織培養(yǎng)研究中，常用莖尖作外植體建立無性快繁體系[6]，楊樹則多使用莖段或葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)分化[7]。

2 外植體對(duì)組培苗無性快繁的影響

在植物的組織培養(yǎng)中，外植體的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中的現(xiàn)象和結(jié)果有重要的影響。從理論上講，由于細(xì)胞全能性，無論選擇植物體的哪一個(gè)部位，都能誘導(dǎo)出新的再生組織，但在實(shí)際的組培實(shí)驗(yàn)過程中，外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織或不定芽，會(huì)因?yàn)橥庵搀w材料的差異性而不同。并且外植體采摘的季節(jié)、幼嫩程度、種類等因素，都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)過程中愈傷組織的褐化率、死亡率及組培苗的生長(zhǎng)等。因此，在組培實(shí)驗(yàn)中，了解外植體的種類及其生理狀態(tài)等是否適合實(shí)驗(yàn)，也是非常重要的步驟[8]。

2.1 不同外植體材料消毒效果

外植體材料的消毒處理，是植物組培實(shí)驗(yàn)過程中的關(guān)鍵一步，影響愈傷組織的褐化率或誘導(dǎo)率，進(jìn)而影響組培苗的存活率。不同的外植體會(huì)因?yàn)樾螤畈灰?，?dǎo)致與消毒劑接觸的面積不同，一定程度上影響外植體消毒后的滅菌效果。鐘俊橋等在無患子組織培養(yǎng)的消毒過程中，以嫩葉片和幼嫩莖段作為外植體，采用相同的方法處理這兩種外植體材料，結(jié)果表明，嫩葉片的消毒效果最佳，能保證較高的存活率，且實(shí)驗(yàn)過程中褐化率為零[9]。在杉木苗組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，饒寶蓉等人用已篩選出的消毒方案處理杉木的去針莖段、莖段、莖尖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莖尖的萌芽率最低且感染率和死亡率最高，但去針莖段則相反，所以該實(shí)驗(yàn)綜合萌芽率、死亡率等指標(biāo)，以去針莖段的消毒效果最佳，更有利于實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行[10]。

不同外植體所帶菌落數(shù)量的不同，也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中外植體的滅菌效果。韓瀛以相同的方法消毒處理半日花嫩葉片和熟葉片，結(jié)果表明，嫩葉的污染率更低，分析原因主要是因?yàn)橛啄廴~片在空氣中暴露的時(shí)間不長(zhǎng)，未受到細(xì)菌的長(zhǎng)期侵入，攜帶菌落數(shù)量較少，通過消毒劑容易達(dá)到良好的滅菌效果[11]。因此在接種過程中，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件或預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選取攜帶污染菌少或滅菌效果好的植物器官作為外植體材料，從而保證實(shí)驗(yàn)可以良好地進(jìn)行。

2.2 外植體種類對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響

外植體的種類較豐富，會(huì)導(dǎo)致所誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差異。如林木類的植物，大多數(shù)以葉片、莖段、胚等作為外植體，可以完成分化誘導(dǎo)的過程，從而培育出新的植株個(gè)體，但多數(shù)研究表明，使用帶芽莖段為外植體材料，可獲得最佳的誘導(dǎo)效果，在這些植物組培實(shí)驗(yàn)中，以帶芽莖段來進(jìn)行誘導(dǎo)分化，具有誘導(dǎo)率高、褐化率低的優(yōu)勢(shì)[12-14]。懷慧明等在紅花玉蘭愈傷組織誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，選用種子、腋芽、葉片、帶芽莖段等4種外植體進(jìn)行誘導(dǎo)處理，結(jié)果表明，以帶芽莖段為外植體時(shí)，愈傷組織的褐化率較低，且組培苗的成活率較高，所以帶芽莖段為紅花玉蘭組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中最佳的外植體材料[15]，這與唐軍榮等研究結(jié)果一致[16]。

木犀科類植物的組培實(shí)驗(yàn)中，最常用的外植體也是帶芽莖段[17]。軟棗獼猴桃的組培快繁實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莖段誘導(dǎo)出愈傷組織的時(shí)間要短于葉柄、葉片等，而且可以降低其褐化率，提高組培苗的生存率[18]。在同源四倍體臺(tái)灣泡桐的組培實(shí)驗(yàn)中，以葉片和葉柄作外植體材料，葉片誘導(dǎo)率最高達(dá)90%，而葉柄的誘導(dǎo)率僅為60%，并且葉片所誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)相對(duì)較好，因此該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為葉片為該泡桐品種的最佳外植體[19]。

除了葉片、莖段等作為外植體材料，種胚也可以作為外植體材料來誘導(dǎo)分化。衛(wèi)矛的相關(guān)組培研究表明，衛(wèi)矛屬植物的莖段、葉片、胚等都能完成誘導(dǎo)分化的過程，繼而獲得新植株，但以腋芽莖段和種胚作為外植體，較容易誘導(dǎo)出新植株，并且再生率較高，而葉片所誘導(dǎo)出的愈傷組中，較難分化出不定芽[20]。因此，研究出最適合自身誘導(dǎo)的外植體種類是提高組培苗的質(zhì)量和數(shù)量的關(guān)鍵。

2.3 外植體年齡對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響

植物的組培實(shí)驗(yàn)中，外植體的誘導(dǎo)效果除了受自身種類的影響外，還與外植體的年齡有關(guān)。研究表明，幼嫩外植體的誘導(dǎo)效果在一定程度上比成熟的外植體更好。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)基因型的西瓜外植體在苗齡為2～5 d時(shí)不定芽誘導(dǎo)率較高[21-22]。在微型月季誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，馮歡以葉片、葉柄 、莖段作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，葉片誘導(dǎo)效果最好，并且以葉片作為外植體時(shí)，隨著葉齡增大，其誘導(dǎo)率增高，直到葉齡為12 d，誘導(dǎo)率達(dá)到峰值，之后誘導(dǎo)率又隨著葉齡的增大而下降[23]。該實(shí)驗(yàn)表明，幼嫩葉片比成熟葉片更適合作為外植體材料，且在一定時(shí)間內(nèi)，其葉片誘導(dǎo)率和葉片年齡成正比。張玲玲在相同的消毒條件下，對(duì)比研究垂絲海棠的幼嫩莖段和生長(zhǎng)成熟莖段的消毒后的誘導(dǎo)效果，結(jié)果顯示，幼嫩莖段發(fā)生誘導(dǎo)后的褐化率和污染率明顯低于成熟莖段，原因可能是幼嫩外植體受外界環(huán)境污染的影響較小，并且較易清洗。該實(shí)驗(yàn)表明，以幼嫩外植體作為誘導(dǎo)材料，實(shí)驗(yàn)效果會(huì)更好，可提高愈傷組織或不定芽存活率[24]。

在大麥的組織培養(yǎng)中，認(rèn)為大麥幼胚是最佳的外植體材料，因?yàn)槠溆着咧杏性偕芰^強(qiáng)的盾片，雖然大麥的成熟胚在植株再生上也有一定的效果，且取材便利，但是其成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量較差，大多不能成功培育出組培苗[25]。

鄭文靜等人使用8個(gè)品種的水稻來探究水稻不同外植體組織培養(yǎng)的差異性，實(shí)驗(yàn)顯示以成熟胚作外植體，誘導(dǎo)率最高達(dá)80%，而以其它的作外植體誘導(dǎo)率小于40%。實(shí)驗(yàn)還表明，成熟胚作外植體時(shí)誘愈率最高，且水稻后代的有利變異率最高[26]。洪青梅等采用相同的消毒試劑和相等的時(shí)間，處理金都一號(hào)火龍果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示幼嫩莖段褐死率較高，達(dá)到66.7%，而近成熟莖段的褐死率則為53.3%，并且其污染率也低于幼嫩莖段的污染率，因此該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，近成熟莖段更適合作金都一號(hào)火龍果組培研究的外植體材料。在植物的組培實(shí)驗(yàn)中，同種外植體材料的誘導(dǎo)效果與年齡有著很大的關(guān)系，在掌握最佳外植體的種類基礎(chǔ)上，了解外植體最合適的年齡，對(duì)實(shí)驗(yàn)有著很大的促進(jìn)效果。

2.4 不同外植體對(duì)愈傷組織和不定芽生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

植物的組培實(shí)驗(yàn)中，外植體的不同也會(huì)影響愈傷組織和不定芽的生長(zhǎng)，只有適合的外植體，才能誘導(dǎo)出生理狀態(tài)健康、顏色良好的愈傷組織或不定芽。在五指毛桃的組培實(shí)驗(yàn)中，將葉片、葉柄、莖段接種于同種培養(yǎng)基上，結(jié)果表明，葉柄分化出的愈傷組織呈淡黃色，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，誘導(dǎo)率低，后期未分化出不定芽；莖段也未誘導(dǎo)出愈傷組織或不定芽，并且存在黃化現(xiàn)象；只有葉片誘導(dǎo)的愈傷組織體積大，呈綠色，且出現(xiàn)少量的分化現(xiàn)象，表明葉片誘導(dǎo)的愈傷組織生理狀態(tài)更好[27]。在垂絲海棠組織培養(yǎng)中，張玲玲以幼嫩的莖段、葉片、花瓣作為外植體材料，出愈率情況為葉片＞莖段＞花瓣。雖然葉片出愈率最高，愈傷組織生長(zhǎng)速度比較快，體積較大，但其組織結(jié)構(gòu)較為松散，花瓣誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色較淺。而莖段出愈率雖略低于葉片，但愈傷組織結(jié)構(gòu)緊致，顏色狀態(tài)也比較好，綜合考慮，莖段是本次實(shí)驗(yàn)中最佳的繼代增殖材料[24]。

在櫻花快繁組培實(shí)驗(yàn)中，以莖段和葉片作外植體進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)莖段和葉片的成活率和誘導(dǎo)率差別不大，但是二者誘導(dǎo)形成的愈傷組織狀態(tài)不一樣，葉片誘導(dǎo)的效果更佳，容易誘導(dǎo)出不定芽，所以以葉片為外植體時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更佳[28]。不同的外植體對(duì)誘導(dǎo)后的愈傷組織和不定芽的生長(zhǎng)狀態(tài)有著不可忽視的影響，要誘導(dǎo)出生理健康、顏色飽滿的愈傷組織或不定芽，需摸索出組培中最適合植物自身的外植體。

2.5 外植體不同對(duì)組培苗無性快繁的其它影響

外植體不同還在其它方面影響組培苗的無性快繁。有些植物中，不同外植體最佳生長(zhǎng)的時(shí)間和狀態(tài)不一樣，因此獲取的條件不相同，優(yōu)先考慮獲取容易的外植體，以節(jié)省人力和財(cái)力。在花毛茛的組培實(shí)驗(yàn)中，常采用葉片為外植體對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，主要是因?yàn)榛ㄇo在生殖階段才有，且生長(zhǎng)年齡適合的花莖誘導(dǎo)效果才好，而用葉片來誘導(dǎo)，可以不受時(shí)間或季節(jié)的限制[29]。李國(guó)樹在葡萄的組培實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)莖尖作外植體材料的誘導(dǎo)效果優(yōu)于莖段、根尖、葉柄等。實(shí)驗(yàn)還表明，外植體的大小通過影響誘導(dǎo)愈傷率，對(duì)植物的誘導(dǎo)效果產(chǎn)生影響，即誘導(dǎo)愈傷率和外植體的大小相關(guān)。外植體的大小要適宜，過大易產(chǎn)生污染，太小易發(fā)生褐化[30]。其次，同樣類型的外植體也會(huì)因采摘時(shí)間不同，對(duì)組培苗產(chǎn)生影響。大多數(shù)研究表明，春季取外植體材料較為適宜。春季植物生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞有活力，獲得的外植體誘導(dǎo)愈傷組織，滅菌效果和誘導(dǎo)率更高[31-33]。崔杰在金葉加拿大楊組織培養(yǎng)及再生體系研究的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3月中旬采集的外植體材料啟動(dòng)率最高，其莖段和葉片的啟動(dòng)率分別達(dá)到86.67%和78.33%，并且外植體材料的污染程度最低，分別為16.67%和18.3%[34]。

3 總結(jié)

組織培養(yǎng)技術(shù)可以大大縮短植物培育的時(shí)限，但是具體某一種植物選擇哪種外植體，在實(shí)驗(yàn)過程中，會(huì)造成事倍功半或是事半功倍的效果。因此選擇外植體，應(yīng)考慮多方面因素。

3.1 植物的外植體種類比較豐富

每種植物所能用的外植體種類是比較豐富的，但外植體種類的不同可能會(huì)產(chǎn)生較大的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異，只有最佳的外植體材料才能獲得最好的效果。不同植物可以參考前人的同科同屬或者同種的植物組培實(shí)驗(yàn)來確定自己試驗(yàn)中的最佳外植體，也可以根據(jù)自己前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行選擇，使后期的實(shí)驗(yàn)達(dá)到預(yù)期的效果。

3.2 外植體的年齡會(huì)影響植物組培實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)效果

部分植物幼嫩的外植體更適合作誘導(dǎo)分化的材料，因?yàn)檫@類外植體和空氣接觸時(shí)間不長(zhǎng)，攜帶細(xì)菌少，滅菌率高，同時(shí)生命力比較活躍，更容易誘導(dǎo)分化出愈傷組織或不定芽。而有的植物成熟的外植體更適合自身的組培實(shí)驗(yàn)，因?yàn)?，成熟的外植體生命力比較強(qiáng)，較能抵御消毒劑的傷害，實(shí)驗(yàn)過程中其褐死率相對(duì)更低。

3.3 外植體的細(xì)胞活力和污染程度因外植體的采集時(shí)間不同而不同

大多數(shù)研究表明，春冬季節(jié)比較適合采集外植體材料，對(duì)其實(shí)驗(yàn)的消毒效果、誘愈率有一定的幫助。

3.4 外植體的大小決定其實(shí)驗(yàn)的滅菌效果和褐化率

外植體的大小需要根據(jù)外植體和植物的種類來決定。