離子色譜法快速測定動物源食品中5種生物胺

趙 好，查河霞，趙士權(quán)

（南京市疾病預(yù)防與控制中心，南京210003）

生物胺是一類具有生物活性和低的相對分子質(zhì)量的含氮有機化合物的總稱［1］，主要由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的。生物胺廣泛存在于各類食品中，是生物體內(nèi)正常的生理組分，起著重要的生理調(diào)節(jié)功能，但是過量的生物胺會對人體產(chǎn)生一定的毒害作用。如果人體攝入了過量的生物胺，尤其是同時攝入多種生物胺而產(chǎn)生了協(xié)同作用時，人體會產(chǎn)生頭痛、腹部痙攣、嘔吐、腹瀉、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等類似過敏的反應(yīng)，嚴重還會危及生命［2］。組胺是幾種常見生物胺中對人體危害最大的生物胺［3］，當人體攝入8～40mg·kg－1組胺時就會產(chǎn)生輕微的中毒反應(yīng)，攝入量為40～100mg·kg－1時會引起中度中毒，攝入量高于100mg·kg－1時會引起嚴重的中毒癥狀。若腐胺和尸胺與組胺同時存在則會抑制組胺的代謝，組胺的毒性在一定程度上被增強了［4］。生物胺對人體的毒害作用大小與人體的攝入量、各種生物胺之間的相互作用以及人體自身的腸道生理功能有關(guān)，少數(shù)敏感人群對生物胺的耐受劑量要遠低于正常人［2］，因此很難確定生物胺的中毒劑量。目前，食品中生物胺的限量尚無統(tǒng)一的國際標準，各國根據(jù)本國的法律、法規(guī)以及具體國情分別制定標準，并且都只是對魚類及其制品中組胺的含量進行了限定。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認定組胺中毒的危害水平為500mg·kg－1。目前，我國對于生物胺的毒性閾值尚無定論，中國科學(xué)院與中國水產(chǎn)品科學(xué)研究院合作編寫的包括《鯖魚組胺中毒風(fēng)險評估》在內(nèi)的多種農(nóng)產(chǎn)品安全風(fēng)險評估為食品中組胺的風(fēng)險評估提供了重要的依據(jù)［5］。

目前，國內(nèi)外研究人員對水產(chǎn)品、肉類、水果、飲料等食品中的生物胺含量展開了研究，主要采用的測定方法有生物酶傳感器法、色譜法、電泳法［6－7］等，其中以高效液相色譜法的應(yīng)用最為廣泛。我國食品衛(wèi)生標準 GB／T 5009．208－2008中規(guī)定的食品中生物胺的測定方法就是高效液相色譜法（紫外檢測器），此方法樣品前處理必須進行衍生化，操作繁瑣。本工作采用離子色譜法快速測定動物源食品中腐胺、尸胺、組胺、亞精胺以及精胺等5種生物胺，試驗無需衍生化，樣品前處理簡單、高效，大大縮短了測定時間。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

IC 2000型離子色譜儀；DS 6型電導(dǎo)檢測器；Dionex CERS 500型抑制器；XS－204型電子天平；H－1850R型高速冷凍離心機；C18固相萃取小柱。

5種生物胺標準儲備溶液：1．00g·L－1，分別稱取腐胺二鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、組胺二鹽酸鹽、亞精胺三鹽酸鹽、精胺四鹽酸鹽標準品［組胺二鹽酸鹽標準品的純度為99．8%，其余標準品的純度均為99．0%］各25．0mg，用水溶解后分別置于25mL容量瓶中，稀釋至刻度，于4℃保存。根據(jù)需要將5種生物胺標準儲備溶液配制成混合標準溶液系列。

甲基磺酸的純度為99．5%，試驗用水為超純水（電導(dǎo)率為0．055μS·cm－1）。

1．2 儀器工作條件

Ionpac CS17分析柱（4mm×200mm），GS17保護柱（4mm×50mm）；抑制電流140mA；電導(dǎo)檢測池溫度為40℃；流量1．00mL·min－1；進樣量25μL，以峰面積定量。淋洗液為甲基磺酸溶液，梯度洗脫程序：0～12．0min時，甲基磺酸溶液的濃度為10mmol·L－1；12．1～26．0min時，甲基磺酸溶液的濃度為35mmol·L－1；26．1～30．0min時，甲基磺酸溶液的濃度為10mmol·L－1。

1．3 試驗方法

取食品樣品，用食品加工機攪勻后分裝備用。

取試樣1．00g至25mL離心管中，加入0．25mol·L－1甲基磺酸（MSA）溶液10mL渦旋1min，在4 ℃下，以12 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液1mL至10mL容量瓶中，用水稀釋至刻度后，經(jīng)C18固相萃取小柱，按儀器工作條件對采集液進行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

5種生物胺混合標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 5種生物胺混合標準溶液的色譜圖Fig．1 Chromatogram of mixed standard solution of 5biogenic amines

由圖1可知：5種生物胺在30min內(nèi)可完全出峰，腐胺與尸胺的分離度稍差，但不影響其定量分析。

2．2 洗脫方式的選擇

試驗測定的5種生物胺與色譜柱固定相的親和能力差異較大，如果采用等度洗脫方式，淋洗液濃度較低時，亞精胺和精胺這兩種親和力強的組分不出峰或者出現(xiàn)保留時間較長的情況，無法達到快速檢測的目的；淋洗液濃度較高時，腐胺與尸胺兩種組分無法分離。試驗采用梯度洗脫的方式，各組分在短時間內(nèi)都被洗脫出來，且有較高的分離度。

試驗參考了文獻［8］的方法并結(jié)合實際情況對淋洗液的梯度條件進行優(yōu)化，優(yōu)化的梯度條件見1．2節(jié)。

2．3 干擾試驗

水產(chǎn)品及發(fā)酵肉類等樣品中一些小分子的陽離子（如 Na＋、Mg2＋、Ca2＋）可能對測定產(chǎn)生干擾，依照試驗方法，此類金屬離子出峰時間最遲的是Ca2＋，干 擾 試 驗 證 明，1 000mg·L－1Ca2＋對0．25mg·L－1腐胺標準溶液并沒有干擾。

2．4 標準曲線和檢出限

按儀器工作條件對5種生物胺的混合標準溶液系列進行測定，以5種生物胺的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明：5種生物胺的質(zhì)量濃度均在0．25～25．0mg·L－1內(nèi)呈線性，其線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比計算方法的檢出限（3S／N），其結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab．1 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2．5 方法的精密度和回收試驗

分別對魚類（金槍魚、鲅魚）、香腸（蒜腸、廣式香腸）、小龍蝦這3類5種食品進行測定，并加入不同量的混合標準溶液進行回收試驗，精密度和回收試驗結(jié)果見表2，表2中“－”為未檢出。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

表2（續(xù)）

由表2可知：腐胺的回收率為87．4%～130%，相對標準偏差（RSD）為0．70%～4．8%；尸胺的回收率為91．7%～124%，RSD 為0．90%～4．4%；組胺的回收率為 83．9%～101%，RSD 為 0．70% ～5．2%；亞精胺的回收率為83．4%～114%，RSD為0．40%～9．3%；腐胺的回收率為81．9%～110%，RSD為0．50%～4．8%。

2．6 樣品分析

將小龍蝦樣品在常溫下放置2d后按試驗方法取樣，提取后按儀器工作條件進行測定，小龍蝦樣品的色譜圖見圖2。

圖2 小龍蝦樣品的色譜圖Fig．2 Chromatogram of the sample of Procambarus clarkii

由試驗結(jié)果可知：小龍蝦樣品已有輕度腐敗的現(xiàn)象，尤其是腐胺與尸胺這兩種生物胺的含量較表2中的本底值明顯增大。

本工作采用離子色譜法快速測定動物源食品中5種生物胺，方法操作簡單，切實可行，精密度與回收率均滿足檢測要求。檢測周期較短，尤其適合突發(fā)中毒事件中對動物源食品中5種常見的生物胺含量的快速測定。

［1］ 何慶華，吳永寧，印遇龍．食品中生物胺研究進展［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19（5）：451－454．

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［5］ 錢永忠，李耘．農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估：原理、方法和應(yīng)用［M］．北京：中國標準出版社，2005．

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