等位基因特異性PCR檢測CYP3A5和MDR-1基因多態(tài)性方法的建立及臨床應用*

吳潔，侯佳展，程倩，李佳垚，李丹丹，尹逸叢，蘇薇

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730)

·臨床檢驗技術研究·

等位基因特異性PCR檢測CYP3A5和MDR-1基因多態(tài)性方法的建立及臨床應用*

吳潔，侯佳展，程倩，李佳垚，李丹丹，尹逸叢，蘇薇

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730)

目的用等位基因特異性PCR(ARMS-PCR)檢測細胞色素P450酶CYP3A5(A6986G) 和多藥耐藥基因MDR-1(C3435T)基因多態(tài)性，探討其與腎移植受者他克莫司(Tac)血藥濃度和劑量比的相關性。方法根據(jù)CYP3A5(A6986G) 和MDR-1(C3435T)基因多態(tài)性位點分別設計ARMS-PCR引物，分析72例腎移植受者外周血基因組DNA中該2個基因位點的多態(tài)性，同時以DNA測序法為金標準進行驗證?；瘜W發(fā)光微粒子免疫分析法測定腎移植受者血Tac濃度，并比較術后1個月時不同基因型受者之間血Tac濃度、Tac劑量/Tac用量的差異。結果建立的ARMS-PCR法與DNA測序法檢測符合率為100%。72例腎移植受者中，CYP3A5 *1/*1、*1/*3和*3/*3基因型的發(fā)生頻率分別為18.1%、31.9%和50.0%，MDR-1 C/C、C/T和T/T基因型的發(fā)生頻率分別為27.8%、58.3%和13.9%。此外，不同CYP3A5基因型腎移植受者的血Tac濃度(P=0.014)和Tac濃度/Tac用量(P=0.019)均存在明顯差異，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，CYP3A5 *3/*3基因型受者血Tac濃度/Tac用量明顯高于*1/*1和*1/*3基因型(P均<0.05)。結論成功建立檢測CYP3A5和MDR-1基因多態(tài)性的ARMS-PCR法，腎移植受者CYP3A5*3基因多態(tài)性與Tac的藥代動力學明顯相關。

等位基因特異性PCR；細胞色素P450酶CYP3A5；多藥耐藥基因MDR-1；基因多態(tài)性

他克莫司(Tac)是鈣調神經(jīng)磷酸酶抑制劑(CNI)家族的成員，以Tac為基礎的免疫抑制藥物已廣泛應用于臨床器官移植后抗排斥反應。然而，Tac的藥物治療窗窄,且生物利用度個體差異大[1]，臨床往往需要根據(jù)血藥濃度來調整用藥劑量。此外，藥物相關的副作用，如腎毒性，神經(jīng)毒性和高血糖，會明顯降低移植后受體的生存質量[2]。因此，移植后盡快達到所需的Tac血藥濃度對于避免排斥或過度免疫抑制，從而限制劑量相關不良反應至關重要。研究表明，藥物代謝酶細胞色素P450CYP3A5基因A6986G(CYP3A5 * 3)多態(tài)性和多藥耐藥基因MDR-1的C3435T多態(tài)性可影響Tac在不同受者體內的吸收和代謝[3-5]。本研究旨在建立等位基因特異性PCR(ARMS-PCR)法檢測CYP3A5基因A6986G和MDR-1基因C3435T單核苷酸多態(tài)性，并探討這2個多態(tài)性位點與腎移植后受者血Tac濃度和劑量比的相關性，以期指導臨床用藥。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 選取2013年9月至2016年9月接受腎移植受者72例，男32 例，女40 例，年齡(38.0±13.9)歲。納入標準：(1)沒有同時接受其他任何移植；(2)受體術后均使用含有Tac+激素的免疫抑制方案；(3)未使用與Tac有相互作用的藥物，且術后未發(fā)生排斥反應。排除標準：患有嚴重心、肝、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，或患有吸收不良綜合征、胃腸切除術后等影響藥物吸收的受者。

1.2主要儀器及試劑 i2000全自動免疫分析儀(美國雅培公司)，Multiskan GO核酸分析儀(美國Thermo公司)，T100基因擴增儀(美國伯樂公司)，DYY-6C電泳儀(北京六一公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(批號：DP348，北京天根公司)，NewBioIndustry 2×NI-Taq PCR Master Mix(批號：303102，天津沙船公司)。

1.3血Tac濃度檢測 術后1個月時，在受者服藥后12 h(即下一次服藥前)，采集受者空腹靜脈全血5 mL， EDTA-K2抗凝，取200 μL用于血Tac濃度檢測，剩余全血置-80 ℃保存，用于基因多態(tài)性檢測。用全血化學發(fā)光微粒子免疫分析法測定血Tac濃度(ng/mL)，同時統(tǒng)計Tac用量(為每天每千克體重的用藥量，mg/kg/d)，最后計算Tac血藥濃度和劑量比(即血Tac濃度/Tac用量)，通過比較濃度劑量比來分析不同基因型受者對Tac藥物代謝情況的差異。

1.4CYP3A5和MDR-1單核苷酸多態(tài)性檢測

1.4.1基因組DNA提取 取200 μL EDTA-K2抗凝外周血，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，50 μL TE緩沖液洗脫。用GO核酸分析儀測定提取DNA的濃度和純度，取濃度在50～200 ng/μL，A260/280 nm比值在1.8～2.0之間的樣本用于后續(xù)實驗，置-20 ℃保存。

1.4.2引物的設計 參照GenBank中CYP3A5和MDR-1基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計等位基因特異性PCR引物，針對CYP3A5(rs776746)和MDR-1(rs1045642)多態(tài)性位點分別各設計2對特異性引物，用以鑒別CYP3A5(A6986G)的3種基因型(AA型即*1/*1野生型，AG型即*1/*3雜合型，GG型即*3/*3突變型) 和MDR-1(C3435T)的3種基因型(C/C野生型，C/T雜合型，T/T突變型)。引物序列見表1，所有引物均由Invitrogen公司合成。

表1 CYP3A5和MDR-1基因多態(tài)性分型等位基因特異性PCR引物

1.4.3等位基因特異性PCR(ARMS-PCR)擴增 每個樣本分為A管和B管， PCR擴增體系均為20 μL。A管中加入引物P1+P2+P4+P6，各0.5 μL，B管中加入引物P1+P3+P5+P6，各0.5 μL。此外，每管加入10 μL 2×NI-Taq PCR Master Mix，1 μL 基因組DNA和7 μL ddH2O。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)含0.5 mg/L溴化乙錠的15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并采用凝膠成像系統(tǒng)進行圖像分析。

1.4.4基因型判讀 取6 μL PCR產(chǎn)物，在含0.5 mg/L溴化乙錠(EB)的15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)分析CYP3A5(A6986G)和MDR-1(C3435T) 位點基因型。對于同一位點，如果僅A管出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，則判定該位點為突變型，如果僅B管出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，則判定該位點為野生型，如A管和B管中均出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，則為雜合子。

1.4.5DNA測序驗證 將上述72例經(jīng)ARMS-PCR法檢測的DNA樣本的PCR產(chǎn)物送至北京天一輝遠公司，通過基因測序驗證ARMS-PCR法的可靠性。

2 結果

2.1腎移植受者CYP3A5和MDR-1基因型檢測結果 分別用ARMS-PCR法和基因測序法對72例腎移植受者標本CYP3A5(A6986G) 和MDR-1(C3435T)基因型進行檢測，兩種方法檢測符合率均為100%(圖1～2)。72例腎移植受者中，CYP3A5 *1/*1、*1/*3和*3/*3基因型的發(fā)生頻率分別為18.1%、31.9%和50.0%，MDR-1 C/C、C/T和T/T基因型的發(fā)生頻率分別為27.8%、58.3%和13.9%。CYP3A5和MDR-1等位基因分布頻率比較的χ2分別為3.029和1.230，P值分別為0.220和0.541，等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡。CYP3A5和MDR-1不同基因型之間年齡、性別組成無明顯性差異。見表2。

注：標本1和2為CYP3A5*1/*3&MDR-1 C/T基因型，標本3和4為CYP3A5*1/*1&MDR-1 C/T基因型。

圖1 等位基因特異性PCR檢測4例腎移植受者CYP3A5(A6986G) 和MDR-1(C3435T)多態(tài)性結果

注：A,CYP3A5 A6986G基因型;B，MDR-1 C3435T基因型；箭頭示突變位點。

圖2 DNA測序檢測CYP3A5(A6986G)和MDR-1(C3435T)多態(tài)性結果

注：Pa，不同基因型間年齡比較；Pb不同基因型間性別比較。

2.2CYP3A5基因型和MDR-1基因型對Tac血藥濃度和劑量比的影響 術后1個月，不同CYP3A5基因型和MDR-1基因型的腎移植受者的Tac血藥濃度、Tac用量及兩者比值見表3。不同CYP3A5基因型間血Tac濃度(P=0.014)和Tac濃度/Tac用量(P=0.019)均存在明顯差異。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，CYP3A5 *3/*3基因型受者血Tac濃度/Tac用量明顯高于*1/*1和*1/*3基因型受者，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，而CYP3A5 *1/*1和*1/*3基因型受者之間則無明顯差異(P>0.05)。MDR-1 C/T和T/T基因型受者血Tac濃度/Tac用量高于C/C基因型受者，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 不同CYP3A5和MDR-1基因型的腎移植受者血Tac濃度與Tac用量比[M(P25,M75)]

3 討論

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。目前認為CYP3A5和MDR-1基因的SNP與Tac在體內的代謝和吸收相關。DNA測序是檢測SNP的金標準，但所需儀器設備成本較高，且耗時較長，難以在一般實驗室及基層醫(yī)院普及。本研究建立了一種較為簡便的ARMS-PCR方法，通過A，B管的同步多重PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳分析，即可實現(xiàn)同時對CYP3A5(A6986G) 和MDR-1(C3435T)基因多態(tài)性位點的判定。分別用該方法和測序法對72例腎移植受者標本該2個基因多態(tài)性位點進行檢測，2種方法檢測符合率達100%，說明此ARMS-PCR方法是可靠的。

CYP3A5基因的第3內含子A6986G的SNP會引起CYP3A5蛋白功能差異。野生型等位基因CYP3A5*1(A6986)可產(chǎn)生功能性蛋白質，突變型等位基因CYP3A5*3(6986G)因提前形成終止密碼而產(chǎn)生無正常功能的蛋白質。多項研究[6-8]表明，不論是移植患者還是其他免疫疾病用藥患者，當服用同等劑量的Tac時，攜帶*3等位基因患者的血藥濃度比攜帶*1等位基因患者明顯升高。本研究結果也證實*3/*3基因型受者血藥濃度與劑量比(C/D)最高，*1/*3基因型其次，*1/*1基因型最低。本研究發(fā)現(xiàn)CYP3A5 *1/*1、*1/*3和*3/*3基因型的發(fā)生頻率分別為18.1%、31.9%和50.0%，CYP3A5 *3/*3是發(fā)生率最高的基因型。另一項對194名腎移植受者中的研究也得到了與本研究相類似的結果，其發(fā)現(xiàn)CYP3A5*1/*1, *1/*3和*3/*3等位基因的發(fā)生頻率分別為 7.7%, 44.8%和 47.4%[9]。一項薈萃(Meta)分析表明，CYP3A5 6986A> G多態(tài)性可影響Tac的藥代動力學和腎移植受者的急性排斥反應和慢性腎毒性的發(fā)生[10]，因此，在腎移植前對患者進行該位點的檢測可預測發(fā)生Tac相關并發(fā)癥的風險。

目前，關于MDR-1 SNPs包括26外顯子C3435T對Tac藥代動力學的影響仍然存在爭議。Ciftci等[5]的研究表明，含有純合突變TT基因型患者的Tac C/D值高于野生CC基因型患者。本研究發(fā)現(xiàn)MDR-1(C3435T) T/T和C/T基因型受者血藥濃度與劑量比C/D高于C/C基因型受者，T/T基因型最高，C/T基因型次之，但差異無統(tǒng)計學意義。考慮到本研究納入例數(shù)較少，因此結果還需要在更大的患者群體中進一步驗證。另外，本研究僅針對包括CYP3A5和MDR-1的2個位點的多態(tài)性進行分析，目前已報道的與Tac吸收和代謝相關的還有其他的多態(tài)性位點。如有學者報道供體MDR-1 C3435T多態(tài)性是Tac治療腎移植受者腎小球濾過率的決定因素[11]，故而仍需進一步研究證實。綜上所述，本研究結果表明，通過ARMS-PCR腎移植受體CYP3A5和MDR-1基因SNP進行檢測將有助于醫(yī)師調整Tac劑量。當CYP3A5和MDR-1雜合子或純合突變基因型患者進行腎移植時，可以在移植后以較低的Tac劑量進行管理。

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2017-07-26)

(本文編輯：許曉蒙)

Establishmentofallele-specificPCRforthedetectionofCYP3A5andMDR-1genepolymorphismsanditsclinicalapplication

WUJie,HOUJia-zhan,CHENGQian,LIJia-yao,LIDan-dan,YINYi-cong,SUWei

(DepartmentofClinicalLaboratory,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollegeHospital,Beijing100730,China)

ObjectiveTo establish an allele-specific PCR method for the detection of cytochrome P-450CYP3A5 (A6986G) and multidrug resistance geneMDR-1 (C3435T) polymorphisms, and investigate the correlations of their polymorphisms with blood tacrolimus (Tac) concentration/dose (C/D) ratio in renal transplant recipients.MethodsThe allele-specific PCR primers were designed according to the polymorphism sites ofCYP3A5 (A6986G) andMDR-1 (C3435T) genes. Then, their polymorphisms in the genomic DNA of peripheral blood samples from 72 renal transplant recipients were analyzed, and the results were validated by DNA sequencing. The blood Tac concentration was determined by the chemiluminescence microparticle immunoassay and the differences of concentration, dose and C/D ratio of blood Tac in renal transplant recipients with different genotypes were compared at 1 month after transplantation.ResultsThe coincidence rate between the established allele-specific PCR and DNA sequencing was 100%. The frequencies ofCYP3A5 *1/*1, *1/*3 and *3/*3 genotypes in 72 renal transplant recipients were 18.1%, 31.9% and 50.0%, respectively, and those ofMDR-1 C/C, C/T and T/T genotypes were 27.8%, 58.3% and 13.9%, respectively. There were significant differences in blood Tac concentration (P=0.014) and Tac C/D ratio (P=0.019) between differentCYP3A5 genotypes of renal transplant recipients. Further analysis found that the Tac C/D ratio ofCYP3A5 *3/*3 genotype was significantly higher than that ofCYP3A5 *1/*1 and *1/*3 genotypes (P<0.05).ConclusionThe allele-specific PCR method for the detection ofCYP3A5 andMDR-1 polymorphisms is successfully established and the polymorphism ofCYP3A5 *3 gene in renal transplant recipients is obviously correlated with the pharmacokinetics of Tac.

allele-specific PCR; cytochrome P-450CYP3A5; multidrug resistance gene; gene polymorphism

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.11

國家自然科學基金項目(81301508)。

吳潔，1982年生，女，副研究員，博士，主要從事疾病分子診斷和標志物篩選研究。

蘇薇，副研究員，大學本科，E-mail:suwei_64@163.com。

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