鎮(zhèn)江地區(qū)諾如病毒分子流行病學(xué)特點(diǎn)及基因型分析*

許金鳳，徐虹，宋寅生，薛淵，邵世和，申紅星

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

·研究生園地·

鎮(zhèn)江地區(qū)諾如病毒分子流行病學(xué)特點(diǎn)及基因型分析*

許金鳳1,2，徐虹2，宋寅生2，薛淵2，邵世和1，申紅星1

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

目的分析2015-2016年鎮(zhèn)江地區(qū)諾如病毒(NoV)的分子流行病學(xué)特點(diǎn)及基因型分布。方法收集鎮(zhèn)江地區(qū)腹瀉患者糞便標(biāo)本，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)NoV衣殼蛋白基因的表達(dá)水平，并對(duì)PCR產(chǎn)物行基因測(cè)序驗(yàn)證； Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行序列進(jìn)化和基因型分析。結(jié)果NoV總陽(yáng)性率為5.30%(85/1 605)，GⅠ組檢出率為0.87%(14/1 605)，GⅡ組檢出率為4.55%(73/1 605)，其中2份樣本同時(shí)檢出感染GⅠ/GⅡ。GⅡ組在10～20歲組中的陽(yáng)性率最高(17.80%)。2015年NoV的檢出率以1月最高，11月、2月次之；2016年以12月最高，3月、4月次之。2015年NoV的基因型以新GII.17型變異株為主(63.89%)，2016年以GII.4 Sydney_2012株為主(35%)。結(jié)論鎮(zhèn)江地區(qū)的NoV以GII組為主，青少年患者陽(yáng)性率高，主要流行季節(jié)為11月至次年4月，主要流行基因型為GII.17型變異株和GII.4 Sydney_2012株。

諾如病毒；分子流行??；基因型

諾如病毒(Norovirus, NoV)屬于杯狀病毒家族，是引起非細(xì)菌性胃腸炎的重要原因之一[1]。目前，NoV已逐漸成為導(dǎo)致世界范圍內(nèi)人群腹瀉的主要原因[1]。NoV病毒存在地區(qū)及人群的差異性[2-3]，為充分了解鎮(zhèn)江地區(qū)腸道NoV感染的分子流行病學(xué)特征及基因型狀況，本研究采集了2015-2016年的鎮(zhèn)江地區(qū)腹瀉人群的標(biāo)本及臨床信息，并進(jìn)行檢測(cè)和序列測(cè)定等分析，以期探究其分子流行病學(xué)特點(diǎn)及基因型分布。

1 材料與方法

1.1樣本采集 收集2015年1月至2016年12月鎮(zhèn)江地區(qū)5家食源性疾病哨點(diǎn)醫(yī)院的病例樣本以及各區(qū)疾控中心檢驗(yàn)科室采集的突發(fā)公共衛(wèi)生事件的病例樣本共1 605份(其中2015年832份，2016年773份)，均為以腹瀉為主的就診病例。腹瀉是指每日排便3次或3次以上，且糞便性狀異常，如稀便、水樣便、粘液便或膿血便等。納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部食源性疾病診斷技術(shù)規(guī)范研討會(huì)規(guī)定的《食源性疾

病診斷標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范》的定義。研究對(duì)象均來(lái)自鎮(zhèn)江及周邊地區(qū)。

1.2主要試劑與儀器 DL 2000 DNA Marker (批號(hào)A20018)、10×Loading buffer(批號(hào)A8401A)、PrimeScriptTMone step RT-PCR Kit Ver.2 (批號(hào)AK3802)均購(gòu)自日本TaKaRa公司；High Pure Viral RNA kit(批號(hào)11696800，德國(guó)Roche公司)；諾如病毒GI/GⅡ核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20150402，江蘇碩世公司)；Biowest瓊脂糖(批號(hào)122015，西班牙Biowest公司)；Gelred核酸染料(批號(hào)150520，上海輝睿公司)；ABI 7500 PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；凝膠電泳儀及Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；PL303電子天平(美國(guó)Mettler toledo公司)。

1.3臨床樣本采集及RNA抽提 制備糞便懸液：將0.1 g固體糞便標(biāo)本或100 μL液體糞便標(biāo)本加至1.5 mL Eppendorf管或2 mL螺口管中，加入1 mL無(wú)核酶ddH2O，置于漩渦震蕩器震蕩3次，每次10 s,靜置10 min，再以8 000 r/min離心5 min，上清液置-70 ℃保存。取上清標(biāo)本200 μL，按照High Pure Viral RNA Kit說(shuō)明書操作提取樣本RNA核酸，置于-70 ℃保存。

1.4引物序列 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物，并送上海生工公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 NoV的RT-PCR擴(kuò)增引物序列

注：所用的兼并堿基代碼B=G/C/T, H=A/C/T, N=A/G/C/T, R=A/G, Y=C/T。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(qRT-PCR)及逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(RT-PCR)

1.5.1qRT-PCR檢測(cè)NoV GⅠ/GⅡ的表達(dá) 以提取保存的樣本RNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，RT-PCR反應(yīng)總體系為25 μL，包括RT-PCR反應(yīng)液7.5 μL，酶混合液(主要成分為逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶)5 μL，NoV GⅠ/GⅡ反應(yīng)液4 μL，DEPC處理H2O 3.5 μL，RNA模板5 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃，10 s，55 ℃退火、延伸40 s，45個(gè)循環(huán)。用PCR 2.0.6軟件在55 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)并檢測(cè)，熒光檢測(cè)通道為FAM和VIC。結(jié)果判讀：Ct值≤35，曲線呈S型且有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期判斷為NoV GI組或GII組陽(yáng)性，Ct值>38或未檢出，判斷為陰性。

1.5.2RT-PCR檢測(cè)ORF2區(qū)VP1基因的表達(dá) RT-PCR總反應(yīng)體系為50 μL，包括PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，10 μmol/L GI/GII上、下游引物各2 μL， RNA 5 μL，無(wú)RNA酶ddH2O 14 μL。循環(huán)參數(shù)：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)。特異性片段經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并用Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照。結(jié)果判讀：GI組陽(yáng)性為在330 bp處有特異性條帶，GII組陽(yáng)性為在387 bp處有特異性條帶。

1.6序列測(cè)定及進(jìn)化樹(shù)分析 取1.5.2中PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，送上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用Mega軟件Clustal W方法進(jìn)行序列比對(duì)，并提交到NoV基因分型網(wǎng)站(http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/)[5]進(jìn)行基因分型。用Mega 6.06軟件及鄰近歸并法(Neighbor-joining, N-J)構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用bootstrap 1000檢驗(yàn)評(píng)價(jià)進(jìn)化樹(shù)的可靠性。用于系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析的NoV參考序列均來(lái)自于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2003及SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。率的比較用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1病毒感染的分布情況 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，NoV總體陽(yáng)性率為5.30%(85/1 605)，其中GI組檢出率為0.87%(14/1 605)，GII組檢出率為4.55%(73/1 605)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.13,P<0.05)。此外，另有2份樣本同時(shí)感染GⅠ/GⅡ組。分層分析結(jié)果表明，男性感染NoV的陽(yáng)性率為6.26%(52/831)，女性陽(yáng)性率為4.26%(33/774)，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.18,P>0.05)。GⅡ組感染者以10～20歲的陽(yáng)性率最高(17.80%)，GⅠ組感染者以30～40歲組的陽(yáng)性率最高(1.64%)。見(jiàn)表2。

2.2NoV感染月份分布情況 2015年共檢測(cè)832份樣本，NoV陽(yáng)性率為5.05%，除12月份無(wú)樣本檢測(cè)外，其他各月份均有NoV的檢出，以1月份的陽(yáng)性率最高(25.0%,3/12)，其次為11月(14.63%,6/14)和2月(占比為12.50%,1/8)。2016年共檢測(cè)773份樣本，NoV陽(yáng)性率為5.56%，以12月份的陽(yáng)性率最高(75.0%,3/4)，其次為3月(26.67%,4/15)和4月(21.15%,11/52)。

表2 NoV感染的分布情況

注：*，表示同時(shí)感染NoV GⅠ/GⅡ組。

2.3NoV基因型分布情況 經(jīng)NoV基因分型分析，2015年的基因型別為GI.、GII.3、GII.4 Sydney_2012、GII.13、GII.17，其中新GII.17型變異株所占比例最高為63.89%。2016年的基因型別為GI.3-GI.8、GII.2、GII.3、GII.4 Sydney_2012、GII.14、GII.17，其中GII.4 Sydney_2012型占比最高，為35%。見(jiàn)表3。

表3 鎮(zhèn)江地區(qū)2015-2016年NoV基因型分布

2.4NV GⅠ/GⅡ組進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果 GI組capsid(ORF2)區(qū)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖1。其中GI型主要以GI.3為主，此外還存在GI.4-GI.8等基因型，相同基因型在一個(gè)進(jìn)化分支上，具有同源性，無(wú)變異株。GII組capsid(ORF2)區(qū)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2。其中GII.17型變異體和GII.4_Sydney2012所占比例最高，31株GII.17型序列中，有3株與1978-2002年的GII.17型在一個(gè)進(jìn)化分支上；另外28株均為新GII.17型變異株，與2014年流行的GII.17型在同一個(gè)大的進(jìn)化分支上，具有同源性。18株GII.4型序列均為GII.4_Sydney2012，與JX459908/NSW0514/AU/GⅡ.4_Sydney2012在一個(gè)進(jìn)化分支上，具有同源性，與X86557/Lordsdale/UK/GⅡ.4_1995存在一定的變異。

注：圓點(diǎn)分別代表本地區(qū)2015-2016年的GⅠ組序列。用不同顏色表示不同型別的序列，粉紅色圓點(diǎn)為GI.5型序列，深綠色圓點(diǎn)為GI.4型序列，淺綠色圓點(diǎn)為GI.6型序列，藍(lán)色圓點(diǎn)為GI.7型序列，黃色圓點(diǎn)為GI.8型序列，紅色圓點(diǎn)為GI.3型序列。

圖1 鎮(zhèn)江地區(qū)NV病毒GⅠ組ORF2(Capsid)區(qū)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2015-2016年的1 605份樣本中，NoV陽(yáng)性率為5.30%，GII組NoV檢出率明顯高于GI組，說(shuō)明NoV是本地區(qū)胃腸道疾病中常見(jiàn)的病毒類型之一[6]，GII組處于優(yōu)勢(shì)地位，與其他文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道的結(jié)果較為一致。本地區(qū)NoV的感染主要集中在11月份至次年4月份，這與國(guó)內(nèi)某些地區(qū)以及其他某些國(guó)家報(bào)道的結(jié)果一致[2, 9-10]。

在年齡分布的數(shù)據(jù)分析上來(lái)看，鎮(zhèn)江地區(qū)0～10歲的學(xué)齡兒童以及60歲以上的老年人主要感染NoV GII組，GII組在10～20歲組中的陽(yáng)性率最高，與其他年齡組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而GI組在人群中無(wú)明顯年齡分布特征。原因推測(cè)10～20歲組的處在學(xué)校等集體環(huán)境居多，一旦感染NoV，容易造成大規(guī)模的流行和傳播。

目前，對(duì)NoV的分型主要針對(duì)ORF2的Capsid區(qū)進(jìn)行。在人群中流行的基因型主要是GII組的17種基因亞型，其中GII.4型是NoV的主要流行株，自20世紀(jì)90年代以來(lái)，引起了至少4次季節(jié)性的腹瀉病大流行[11]，而GII.17型在2014年以后，在上海、廣東、浙江及香港等地發(fā)現(xiàn)GII.17型序列[12-15]，這充分表明了GII.17型NoV在國(guó)內(nèi)從2014年開(kāi)始逐漸增多。本地監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)江地區(qū)存在多種NoV基因型，2015年以GII.17型為主，2016年以GII.4 Sydney_2012型為主，NoV基因型別處于動(dòng)態(tài)變化中。本次檢測(cè)的NoV GII.17型是一種新的GII.17型變異株，2014年10月在江蘇省首次被檢出后，2015年2月成為主要的流行株[16]。鎮(zhèn)江地區(qū)在2014年12月首次檢出，隨后引發(fā)了幾起由NoV GII.17型引起的突發(fā)疫情[17]。鎮(zhèn)江地處長(zhǎng)江沿岸，很容易引起NoV通過(guò)水源的傳播，本地區(qū)人群普遍缺乏新的GII.17型變異株的抗體，容易導(dǎo)致突發(fā)疫情的發(fā)生。本地檢出的GII.4型為最新的GII.4變異株：GII.4 Sydney_2012株，也是容易引起NoV暴發(fā)流行的病毒株，但是近2年鎮(zhèn)江地區(qū)并未發(fā)生因GII.4 Sydney_2012株感染引起的暴發(fā)疫情，一方面說(shuō)明此型別NoV的毒力有所降低，不容易引起暴發(fā)感染，僅在監(jiān)測(cè)中可以零星發(fā)現(xiàn)，另一方面也說(shuō)明本地人群可能已經(jīng)具有抵抗此型病毒的抗體，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

注：圓點(diǎn)代表2015-2016年的GII組序列。不同型別的進(jìn)化分支分別用不同顏色表示。

圖2 鎮(zhèn)江地區(qū)NV GII組Capsid(ORF2)區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

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2017-06-30)

(本文編輯：許曉蒙)

MolecularepidemiologicalcharacteristicsandgenotypeanalysisofnorovirusinZhenjiangregion

XUJin-feng1,2,XUHong2,SONGYin-sheng2,XUEYuan2,SHAOShi-he1,SHENHong-xing1

(1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhenjiangCenterforDiseasePreventionandControl,Zhenjiang212000,Jiangsu,China)

ObjectiveTo analyze the molecular epidemiological characteristics and genotype distribution of norovirus in Zhenjiang region during 2015 and 2016.MethodsThe fecal samples from diarrhea patients in Zhenjiang region were collected, and the expression level of norovirus capsid protein gene was detected by reverse transcription PCR (RT-PCR). The PCR products were validated by gene sequencing. Then, phylogenetic tree was constructed with Mega software, and sequence evolution and genotype were analyzed.ResultsThe positive rate of norovirus infection was 5.30% (85/1 605). Among them, the detection rates of GⅠ genogroup and GⅡ genogroup were 0.87% (14/1 605) and 4.55% (73/1 605), respectively, and 2 samples were detected both of GⅠ and GⅡ genogroups. The highest positive rate of GⅡ genogroup occurred in adolescent patients aged from 10 to 20 years (17.80%). During 2015, the detection rate of norovirus infection was the highest in January, and then in November and February. During 2016, the detection rate of norovirus infection was the highest in December, and then in March and April. The main genotypes of norovirus in 2015 and 2016 were new GⅡ.17 variant (63.89%) and GⅡ.4 Sydney_2012 strain (35%), respectively.ConclusionThe infection of norovirus in Zhenjiang region appears GⅡ as main genogroup, adolescent as main patients, November to April of the next year as main epidemic seasons, and GⅡ.17 variant and GⅡ.4 Sydney_2012 strain as main epidemic genotypes.

norovirus; molecular epidemic disease; genotype

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.14

鎮(zhèn)江市衛(wèi)生科技重點(diǎn)專項(xiàng)項(xiàng)目(SHW2015015)；鎮(zhèn)江市科技計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(SH2015083)。

許金鳳，1981年生，女，主管技師，碩士研究生，主要從事病原生物學(xué)研究。

邵世和，教授，博士研究生導(dǎo)師， E-mail：shaoshihe2006@163.com；申紅星，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：hxshen@ujs.edu.cn。

Q939.4

A