IL-6-174G>C基因多態(tài)性與南京地區(qū)漢族人群冠心病的相關(guān)性*

王躍幫,魏紅霞,徐志曄,王彥,張葵1,

(1.南京醫(yī)科大學鼓樓臨床醫(yī)學院，南京 210008；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京 210008；3.宿遷市第一人民醫(yī)院，宿遷 223800；4.常州市第二人民醫(yī)院，常州 213000)

·臨床實驗研究·

IL-6-174G>C基因多態(tài)性與南京地區(qū)漢族人群冠心病的相關(guān)性*

王躍幫1,2,3,魏紅霞2,徐志曄2,王彥4,張葵1,2

(1.南京醫(yī)科大學鼓樓臨床醫(yī)學院，南京 210008；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京 210008；3.宿遷市第一人民醫(yī)院，宿遷 223800；4.常州市第二人民醫(yī)院，常州 213000)

目的探討IL-6基因啟動子區(qū)域-174G>C基因多態(tài)性與南京漢族人群冠心病(CHD)的關(guān)系。方法聚合酶鏈-限制性片段多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測235例CHD患者和175例體檢健康者，分析各組IL-6-174G>C基因多態(tài)性，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，選取部分DNA樣本進行基因測序，以驗證其基因型。同時檢測各組血脂、Glu、C反應蛋白、糖化血紅蛋白的表達水平。結(jié)果CHD組和健康人對照組GG、GC、CC基因型頻率分別為98.7%、1.3%、0和97.7%、2.3%、0，G、C等位基因頻率分別為99.4%、0.6%和98.9%、1.1%，基因型和等位基因頻率在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，與健康人對照組相比，CHD組吸煙、SBP、DBP、TG、CHOL、HDL-C、ApoA-I、ApoB、CRP、HbA1c差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，而年齡、性別、Glu差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結(jié)論IL-6-174G>C基因多態(tài)性與南京地區(qū)漢族人群CHD沒有明顯的相關(guān)性。

白細胞介素-6；基因多態(tài)性；冠狀動脈粥樣硬化性心臟病

傳統(tǒng)的觀點認為高血脂和脂蛋白代謝異常是冠心病(CHD)最強風險預測因子，盡管人們注意飲食方式、鍛煉及使用抗血小板聚集和降脂藥物，但CHD的發(fā)病率依然居高不下[1]，炎癥因子在動脈粥樣硬化、CHD的發(fā)生過程中起重要作用，IL-6作為一種重要的炎性細胞因子，通過細胞因子網(wǎng)絡促進冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生,而冠狀動脈粥樣硬化是誘發(fā)冠心病的重要危險因素[2-3],多項研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因啟動子上游區(qū)域基因多態(tài)性與CHD的發(fā)生密切相關(guān)，種族和地區(qū)的不同，其基因頻率和分布亦存在差異[4-6]，本研究旨在分析IL-6-174G>C基因多態(tài)性和南京漢族CHD人群之間的關(guān)系，為進一步闡述CHD的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2017年3-7月南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院心內(nèi)科確診的CHD患者，共計235例，男138例，女97例，年齡(65.0±10.8)歲，其中穩(wěn)定性心絞痛55例，不穩(wěn)定性心絞痛148例，急性心肌梗死32例。CHD診斷標準：(1)有胸痛癥狀；(2)心電圖:S-T段異常；(3)心肌酶異常；(4)有冠狀動脈搭橋的病史；(5)冠狀動脈管腔狹窄大于50%。同時滿足條件(1)、(2)、(3)或(4)、(5)中任意一條即可。排除標準：患惡性腫瘤、白血病、肺栓塞、心肌病、主動脈瘤、自身免疫性疾病、心臟瓣膜病以及嚴重感染者。對照組選擇同期體檢健康者175例，男107例，女68例，年齡(62.7±11.2)歲。兩組人群均無血緣關(guān)系，本研究經(jīng)南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，研究對象知情同意。

1.2主要儀器和試劑 Thermal Cycler PCR儀(美國ABI公司)，F(xiàn)R-200A全自動紫外分析儀(上海復日科技公司)，糖化血紅蛋白儀、DNA電泳儀 (美國Bio-Rad公司)，Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀(美國Beckman公司)；三酰甘油(TG)檢測試劑盒(批號：170921，中生北控公司)，總膽固醇(CHOL)檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒(批號：257AFK、405AFI、619AFI，日本協(xié)和公司)，載脂蛋白A-I(ApoA-I)試劑盒、載脂蛋白B(Apo-B)檢測試劑盒、葡萄糖(Glu)檢測試劑盒(批號：17010307、17030704、17042803，寧波美康公司),C反應蛋白(CRP)測定試劑盒(批號：041704，四川邁克公司)，糖化血紅蛋白儀檢測試劑盒(批號：64070792，美國Bio-Rad公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(批號：8480884，德國Qiagen公司)，PCR擴增試劑2×Taq Master Mix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、優(yōu)化的緩沖液和PCR增強劑，批號：0507041)購自近岸蛋白質(zhì)公司，限制性內(nèi)切酶sfaNI(批號：1101602，美國NEB公司)。

1.3樣本采集 分別采集CHD患者住院第1天和體檢健康者體檢時晨起空腹(禁食8～12 h)靜脈血2管各3 mL，其中1管為含分離膠的促凝管，2 500×g離心15 min，血清樣本置-20 ℃保存，用于測定生化指標；另1管經(jīng)EDTA-K2抗凝，用于提取全血基因組DNA和糖化血紅蛋白檢測，檢測均于當日完成,DNA樣本置-20 ℃保存。

1.4生化指標測定 TG檢測采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法(參考范圍：0.56～1.7 mmol/L)，HDL-C檢測采用化學修飾酶法(參考范圍：0.94～2.00 mol/L)，ApoA-I、ApoB和CRP檢測采用免疫比濁法(參考范圍分別為：1.00～1.60 g/L、0.6～1.20 g/L、≤8.0 mg/L),LDL-C檢測采用選擇性可融化法(參考范圍：1.89～3.10 mol/L)，CHOL檢測采用酶法(參考范圍：2.9～5.72 mmol/L)，Glu檢測采用己糖激酶法(參考范圍：3.89～6.11 mmol/L)，HbA1c檢測采用高效液相色譜法(參考范圍：4.2%～6.0%)。各指標檢測嚴格按照實驗室標準操作規(guī)程的相關(guān)要求執(zhí)行，實驗結(jié)果根據(jù)各項目參考范圍與westgard質(zhì)控規(guī)則綜合分析。

1.5全血基因組DNA模板制備 按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作要求提取全血基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，選取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0之間的樣本用于后續(xù)試驗，樣本置-20 ℃保存。

1.6聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性方法檢測IL-6-174G>C基因多態(tài)性 根據(jù)IL-6在GeneBank中序列號(AF048692.1)，參考文獻[7],用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物序列：5′-ATGCCAAAGTGCTGAGTCACTA-3′,下游引物序列:5′-TCGAGGGCAGAATGAGCCTC-3′，產(chǎn)物片段大小為308 bp，Tm 56 ℃。引物由上海捷瑞公司合成。PCR反應體系為50 μL,包括2×Taq Master Mix 25 μL，模板DNA(約100 ng) 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，經(jīng)DEPC處理的ddH2O 21 μL。PCR循環(huán)參數(shù):94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物鑒定和酶切分析:取5 μL PCR產(chǎn)物直接經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠(120 V,15 min)電泳，用于驗證引物特異性和預估PCR產(chǎn)物濃度；酶切反應總體系為50 μL，包括PCR產(chǎn)物10 μL，DEPC處理的ddH2O 34 μL, 10×NE buffer 5 μL，限制性內(nèi)切酶SfaN I 1 μL。37 ℃水浴酶切60 min，酶切產(chǎn)物經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠(120 V，20 min)電泳，以DL 1000 DNA Maker為標準，F(xiàn)R-200A紫外分析儀照相，根據(jù)酶切條帶分布判斷IL-6-174G>C基因多性:經(jīng)酶切后GG野生型為2條帶，GC雜合型為3條帶，CC突變型為1條帶。分別選取GG型和GC型的PCR產(chǎn)物各2份，送安徽通用公司進行基因測序。

2 結(jié)果

2.1各組臨床資料比較 與健康人對照組相比,CHD組吸煙、SBP、DBP、TG、CHOL、HDL-C、HDL-C、ApoA-I、ApoB、CRP、HbA1c差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而年齡、性別、Glu差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組研究對象基本情況見表1。

表1 各組一般臨床資料的比較

注：與健康人對照組比較，*，P<0.05。

2.2基因型結(jié)果 CHD組IL-6-174G>C位點PCR擴增產(chǎn)物片段約為308 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SfaNI酶切，GG野生型出現(xiàn)2條帶，大小分別為203 bp、105 bp；GC雜合突變型出現(xiàn)3條帶，大小分別為308 bp、203 bp、105 bp，CC純合突變型僅為1條帶，大小為308 bp，本研究未見CC型。PCR及酶切電泳結(jié)果見圖1。GG型和GC型測序結(jié)果見圖2。

注：M，DL 1000 maker；1,2,7，PCR產(chǎn)物,3,4，GC型；5,6為GG型。

圖1 PCR產(chǎn)物及酶切電泳圖

注：A,IL-6-174 GG型；B，IL-6-174 GC型;箭頭示堿基突變位點。

圖2 PCR產(chǎn)物部分測序結(jié)果

2.3基因型和等位基因頻率比較 本研究人群IL-6-174G>C基因多態(tài)性僅見GG和GC型，未見CC型，GG型和GC型在CHD組和對照組頻率分布為98.7%、1.3%和97.7%、2.3%，G、C等位基因的頻率分別為97.7%和98.9%、1.1%、2.3%。各基因型和等位基因頻率在兩組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 基因型和等位基因頻率分布

3 討論

研究表明，IL-6濃度與CHD的嚴重程度密切相關(guān)，且受基因水平的調(diào)控，IL-6-174G>C多態(tài)性位點可能影響其表達[5]。本研究結(jié)果顯示，年齡、性別在CHD組和健康人對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，吸煙在兩組間差異有統(tǒng)計學義(P<0.05)，CHD患者的TG、CRP、HbA1c和收縮壓、舒張壓與健康人對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而HDL-C、LDL-C、CHOL、ApoA-I、ApoB較健康人對照組明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高Glu和高LDL-C是CHD的傳統(tǒng)危險因素，在本研究中LDL-C血清濃度水平低于健康人對照組，Glu在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其原因可能是納入本研究的患者存在CHD和糖尿病病史，長期服用降血脂和血糖等藥物，他汀類等降脂藥能明顯降低血清TC、LDL-C、ApoB水平[6]。高血壓是CHD的重要致病因素，導致血管硬化，促進斑塊形成，本研究中CHD組收縮壓為(137.43±18.70)mmHg，明顯高于健康人對照組(P<0.05)。CRP是炎癥反應因子，在本研究中CHD組CRP水平明顯高于健康人對照組(P<0.05)，表明炎癥因子可能促進CHD的發(fā)生。

此外，本研究用PCR-RFLP技術(shù)檢測IL-6-174G>C多態(tài)性，結(jié)果顯示IL-6-174G>C基因分布符合Hardy-Weinberg遺傳定律，具有群體代表性，南京地區(qū)漢族人群IL-6-174位點以G等位基因為主，主要為GG型，GC型少見，未見CC型，其GG、GC、CC基因型頻率分別為98．3%、1．7%、0(CHD組)和98．9%、1．1%、0(健康人對照組)，GG(野生型)基因型頻率明顯高于GC(雜合突變型)基因型頻率，從表2可知，IL-6-174G>C基因型GG、GC以及等位基因G、C在兩組間分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明IL-6-174G>C基因多態(tài)性與南京地區(qū)漢族人群CHD之間并不存在相關(guān)性，本研究結(jié)果與買尼沙買買提等[7]和Bhanushali等[8]的研究結(jié)果較為一致。Elsaid等[9]對108例埃及CHD患者研究發(fā)現(xiàn)攜帶IL-6-174 G等位基因的個體的發(fā)病風險是攜帶C等位基因的3.95倍，Satti 等[10]對162名巴基斯坦人研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶IL-6-174C等位基因的個體風險比IL-6-174 G基因的明顯增高，OR值為3.4。兩研究結(jié)果均高于本研究，原因可能與選擇人群的種族和地域有關(guān)。CHD是多基因遺傳疾病，易受基因和環(huán)境多重影響，基因頻率因為種族、環(huán)境和地區(qū)不同等位基因的分布頻率亦不同[11]，本實驗結(jié)果表明，在CHD組IL-6基因啟動子-174G等位基因占99.4%，C等位基因占0.6%，突變率小于1%，無純合突變，與健康人對照組比較無明顯差別(P>0.05)，亦表明IL-6-174G>C位點的基因多態(tài)性與南京地區(qū)漢族人群CHD的發(fā)生無明顯的關(guān)系。然而本實驗由于受到種族、病例數(shù)量和地域的限制，未能夠進一步分析IL-6-174G>C以及其他相關(guān)基因多態(tài)性和其他種族、地區(qū)CHD人群之間的關(guān)系。

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2017-05-24)

(本文編輯：許曉蒙)

Associationofinterleukin-6gene-174G>CpolymorphismanwithcoronaryheartdiseaseofChineseHanpopulationinNanjingarea

WANGYue-bang1,2,3,WEIHong-xia2,XUZhi-ye2,WANGYan4,ZHANGKui1,2

(1.DrumTowerClinicalMedicineofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,Jiangsu; 2.ClinicalLaboratory,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing21008,Jiangsu; 3.TheFirstHospitalofSuqianCity,Suqian223800,Jiangsu; 4.TheSecondPeople'sHospitalofChangzhou,Changzhou213000,Jiangsu,China)

ObjectiveTo investigate the relationship of -174G>C polymorphism of interleukin 6 (IL-6) gene promoter region upstream-with coronary heart disease (CHD) of Chinese Han population in Nanjing area.MethodsThe polymorphism ofIL-6-174G>C gene was confirmed in 235 patients with CHD and 175 healthy individuals by PCR-RFLP, and Hardy-Weinberg equilibrium was tested. DNA samples were selected for sequencing to verify their genotype. The concentration of blood sugar, lipid, C reaction protein (CRP) and glycosylated hemoglobin (HbA1c) in the samples were measured simultaneously.ResultsThe genotype distributions of GG, GC and CC were 98.7%, 1.3% and 0 in CHD group and 97.7%, 2.3% and 0 in control group, respectively. The frequencies of G and C alleles were 99.4%, 0.6% and 98.9%, 1.1% in the two groups. There were no statistical significance for frequencies of genotype and alleles between the two groups (allP>0.05). Compared with the control group, the differences of smoking, systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP), triglyceride (TG), cholesterol (CHOL), low-density lipoproteins-cholesterol (LDL-C), high-density lipoproteins-cholesterol (HDL-C), apolipoprotein A-I (ApoA-I), ApoB, CRP and HbA1c were statistically significant (allP<0.05), while age, sex and blood glucose were not statistically significant (allP>0.05).ConclusionIL-6-174 G>C gene polymorphism should not remarkably correlated with CHD in Chinese Han population in Nanjing area.

interleukin-6；coronary heart disease；gene polymorphism

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.13

南京市醫(yī)學科技發(fā)展一般項目(YKK15083)。

王躍幫，1984年生，男，主管技師，大學本科，研究方向: 炎癥因子與心血管疾病的關(guān)系。

張葵，教授，碩士研究生導師，E-mail:13505151066@163.com。

R541.4

A