貞芪扶正顆粒的HPLC指紋圖譜研究Δ

魏曉雨，姜國棟，陳泓，王美慧，徐杰，邊雨，姜文月#（.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，長春 300；.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，吉林通化 34000）

貞芪扶正顆粒的HPLC指紋圖譜研究Δ

魏曉雨1＊，姜國棟2，陳泓2，王美慧1，徐杰1，邊雨1，姜文月1#（1.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，長春 130012；2.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，吉林通化 134000）

目的：建立貞芪扶正顆粒的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLCELSD）。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，檢測(cè)器蒸發(fā)光溫度為50℃，進(jìn)樣量為10 μL。以特女貞苷為參照，測(cè)定7批貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A）版進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：7批貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜有13個(gè)共有峰。經(jīng)驗(yàn)證，7批樣品HPLC圖譜中有3批樣品相似度＞0.9，與對(duì)照指紋圖譜具有較好一致性；4批樣品相似度＜0.9，與對(duì)照指紋圖譜一致性較差。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為貞芪扶正顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

貞芪扶正顆粒；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；指紋圖譜；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

貞芪扶正顆粒由女貞子和黃芪兩味藥材組成[1]，收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（第20冊(cè)），具有提高人體免疫力，保護(hù)骨髓及腎上腺皮質(zhì)的功能[2-3]。大量藥學(xué)研究和臨床應(yīng)用已證實(shí)其可以作為癌癥治療的輔助藥物[4-6]。目前全國注冊(cè)在案的貞芪扶正顆粒生產(chǎn)企業(yè)共有11家，分為無糖型及有糖型兩種，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)組方中黃芪藥材所含的黃芪甲苷進(jìn)行定性及定量分析[7]，而未對(duì)女貞子藥材有任何限定。中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性為其質(zhì)量控制增加了難度，只對(duì)單一成分或特征性成分研究不能全面控制其質(zhì)量穩(wěn)定性[8-11]，而指紋圖譜技術(shù)能夠全面呈現(xiàn)樣品的復(fù)雜性，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系中[12-13]。鑒于此，筆者采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD）建立了貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜[14]，運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)方法對(duì)7批貞芪扶正顆粒的HPLC圖譜進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)，并進(jìn)行特征峰指認(rèn)，以期為完善該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

RIGOL L-3000型HPLC儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、蒸發(fā)光檢測(cè)器（北京普源精電科技有限公司）；ME204E型雙量程電子分析天平（瑞士Mettl-er-Toledo公司）；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)（寧夏新芝生物科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

貞芪扶正顆粒（A廠，批號(hào)：S1，無糖型，規(guī)格：5g/袋；B 廠，批號(hào)：S2，無糖型，規(guī)格：5 g/袋；C廠，批號(hào)：S3，無糖型，規(guī)格：5 g/袋；D 廠，批號(hào)：S4，有糖型，規(guī)格：15 g/袋；E 廠，批號(hào)：S5，有糖型，規(guī)格：15 g/袋；F 廠，批號(hào)：S6，無糖型，規(guī)格：5 g/袋；G廠，批號(hào)：S7，有糖型，規(guī)格：15 g/袋）；芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)：111703-200501，純度：98.8%）、紅景天苷對(duì)照品（批號(hào)：110818-201206，純度：93.4%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201505，純度：97.6%）、特女貞苷對(duì)照品（批號(hào)：111926-201404，純度：93.3%）、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201515，純度：97.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

試驗(yàn)用藥材均購自某藥店，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院張連學(xué)教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，95%→90%A；10～30 min，90%→78%A；30～40 min，78%→73%A；40～65 min，73%→48%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)器蒸發(fā)光溫度：50℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取芒柄花素對(duì)照品5.23 mg、紅景天苷對(duì)照品4.45 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品4.67 mg、特女貞苷對(duì)照品5.34 mg、黃芪甲苷對(duì)照品5.64 mg，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含芒柄花素0.523 mg、紅景天苷0.445 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.467 mg、特女貞苷0.534 mg、黃芪甲苷0.564 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取有糖型樣品15 g（無糖型樣品5 g），精密稱定，精密加入甲醇50 mL，超聲（功率：220 W，頻率：33 kHz，下同）處理15 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，通過D101大孔樹脂（柱高：12 cm，內(nèi)徑：1.5 cm），以3倍柱體積的水進(jìn)行洗脫，棄去水液；再分別用3倍柱體積的30%乙醇溶液、60%乙醇溶液、95%乙醇溶液依次洗脫，收集上述洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，并定容?0 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 單味藥材溶液 精密稱取“1.3”項(xiàng)下黃芪藥材粉末及女貞子藥材粉末（過3號(hào)篩）各約1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得單味藥材溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以特女貞苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.5%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以特女貞苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.5%（n＝10），相對(duì)峰面積的RSD＜2.0%（n＝10），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以特女貞苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.5%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成、共有峰的歸屬和指認(rèn)及相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取7批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）對(duì)7批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 7批樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 7 batches of samples and control fingerprints

2.4.2 共有峰的歸屬和指認(rèn) 比較圖2中各色譜（其中5號(hào)為參照峰）并對(duì)HPLC圖譜共有峰進(jìn)行歸屬和指認(rèn)。結(jié)果顯示，樣品HPLC圖譜13個(gè)共有峰中1、2、4、5、6、7號(hào)峰來源于女貞子，3、8、9、10、11、12、13號(hào)來源于黃芪。共有峰中1、3、5、9、10號(hào)色譜峰分別指認(rèn)為紅景天苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷、芒柄花素、黃芪甲苷，經(jīng)統(tǒng)計(jì)上述5個(gè)色譜峰面積之和約占共有峰總面積的60%。

2.4.3 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)7批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，7批樣品HPLC圖譜中有3批樣品相似度＞0.9，4批樣品相似度＜0.9，詳見表1；各共有峰的相對(duì)保留峰面積和相對(duì)保留時(shí)間見表2和表3。

表1 7批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of 7 batches of samples

表2 7批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks in HPLC fingerprints of 7 batches of samples

表3 7批樣品HPLC共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of 7 batches of samples

3 討論

3.1 提取方式及提取溶劑的確定

本研究比較了加熱回流與超聲兩種提取方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者沒有明顯差異，但超聲提取法操作更簡(jiǎn)單、快捷且溶劑損耗少，故選取超聲提取法作為本研究的提取方法。本研究也比較了不同提取溶劑（80%甲醇溶液、甲醇）的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑時(shí)，雜質(zhì)較少且澄清，色譜峰形好、基線平穩(wěn)，故選取甲醇為提取溶劑。

3.2 色譜柱和流動(dòng)相的選擇

本研究對(duì)比了Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）與ACE5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）分離效果較好，因此選擇上述色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)。還比較了甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)的色譜分離情況，結(jié)果以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，所得色譜分離度較好，基線平穩(wěn)，有利于各色譜峰的分析。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-水為流動(dòng)相。

3.3 不同廠家貞芪扶正顆粒基于相似度的質(zhì)量差異分析

本試驗(yàn)首次建立了貞芪扶正顆粒HPLC的指紋圖譜，標(biāo)定了13個(gè)共有峰，為有效控制貞芪扶正顆粒成品的質(zhì)量提供了理論依據(jù)。本試驗(yàn)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A）對(duì)所得的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，并與所生成的對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，結(jié)果7批樣品HPLC指紋圖譜中有3批樣品相似度＞0.9，與對(duì)照指紋圖譜具有較好一致性；4批樣品相似度＜0.9，與對(duì)照指紋圖譜一致性較差。說明不同廠家樣品在成分的比例上有所差異，而造成這種差異可能與成品原料質(zhì)量有關(guān)。黃芪及女貞子屬于廣泛種植藥材，地域等的不同可能造成藥材成品間含量差異較大；其次，各廠家生產(chǎn)工藝也不盡相同，最終導(dǎo)致各廠家成分質(zhì)量差異較大。因此，對(duì)中藥制劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究是控制中藥制劑質(zhì)量穩(wěn)定的重要措施，從藥材源頭進(jìn)行控制，對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定，才能有效降低不同廠家同品種間療效的差異。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為貞芪扶正顆粒的鑒別質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

[1]國家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑：第20冊(cè)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011：117.

[2]胡少明，董慧，涂勝豪，等.貞芪扶正顆粒聯(lián)合化療治療胃癌的臨床研究[J].中國藥師，2005，8（9）：761-763.

[3]張超賢，郭李柯，郭曉鳳.電針聯(lián)合貞芪扶正顆粒對(duì)肝纖維化大鼠自由基反應(yīng)、NF-κB 活化、TGF-β1和 CTGF mRNA表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2014，34（9）：2512-2516.

[4]陳云.貞芪扶正顆粒對(duì)食管癌化療患者生存質(zhì)量及免疫功能的影響[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35（10）：1025-1027.

[5]江瑾，吳祥.貞芪扶正顆粒治療胸部腫瘤三維適形放療毒副反應(yīng)25例[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2014，34（3）：37-38.

[6]陳康桂，肖波，黃群英.經(jīng)穴自血療法聯(lián)合貞芪扶正顆粒防治緩解期小兒支氣管哮喘臨床研究[J].新中醫(yī)，2016，48（2）：21-23.

[7]國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：WS3-B-3831-98-2002[S].2002.

[8]吳杏梅，廖華衛(wèi)，蔡先東，等.HPLC-ELSD法測(cè)定貞芪扶正片黃芪甲苷的含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（10）：1-2.

[9]劉俊有，慕楊娜，季雪，等.高效液相色譜法測(cè)定貞芪扶正顆粒特女貞苷含量[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2015，29（3）：135-136.

[10]胡芳弟，封士蘭，趙健雄.RP-HPLC測(cè)定貞芪扶正制劑中兩種異黃酮類成分的含量[J].中成藥，2004，26（9）：19-21.

[11]程偉，石曉偉，張嫡群，等.貞芪扶正膠囊中黃芪甲苷和紅景天苷的含量測(cè)定[J].中成藥，2006，28（5）：658-662.

[12]牛小花，陳洪源.清喉利咽顆粒的UPLC指紋圖譜建立及主成分分析[J].中國藥房，2017，28（6）：826-830.

[13]吳健，高家榮，韓燕全，等.芪歸糖痛寧顆粒的UPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2014，25（11）：1022-1024.

[14]陶金華，狄留慶，文紅梅，等.中藥指紋圖譜譜效相關(guān)性研究思路探討[J].中國中藥雜志，2009，34（18）：2410-2411.

Study on HPLC Fingerprint of Zhenqi Fuzheng Granules

WEI Xiaoyu1，JIANG Guodong2，CHEN Hong2，WANG Meihui1，XU Jie1，BIAN Yu1，JIANG Wenyue1（1.Jilin Modern TCM Engineering and Research Center Co.，Ltd.，Changchun 130012，China；2.Xiuzheng Pharmaceutical Group Co.，Ltd，Jilin Tonghua 134000，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of Zhenqi fuzheng granules.METHODS：HPLC-ELSD method was adopted.The determination was performed on Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min with column temperature of 40 ℃.The detector evaporation temperature was 50 ℃，and sample size was 10 μL.Using specnuezhenide as reference，HPLC chromatograms of 7 batches of Zhenqi fuzheng granules were determined.The identification and similarity evaluation of common peaks were conducted by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）.RESULTS：There were 13 common peaks in HPLC chromatograms of 7 batches of samples.After validated，the similarity of 3 batches of samples in HPLC chromatograms of 7 batches of samples were higher than 0.9，which were in good agreement with control fingerprints.The similarity of 4 batches of samples were＜0.9，which were poorly same to control fingerprint.CONCLUSIONS：Established fingerprint can provide reference for quality evaluation of Zhenqi fuzheng granules.

Zhenqi fuzheng granules；HPLC-ELSD；Fingerprint；Quality standard

R927

A

1001-0408（2017）33-4691-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.23

國家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（No.ZYBZH-C-JL-26）；吉林省醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)引導(dǎo)資金項(xiàng)目（No.YYZX201503）

＊助理工程師，碩士。研究方向：中藥二次開發(fā)。E-mail：weixiaoyu1547@163.com

#通信作者：工程師，博士。研究方向：新藥及保健食品開發(fā)。電話：0431-89255017。E-mail：542030923@qq.com

（編輯：劉 柳）

2017-06-16

2017-09-15）