雙波長HPLC法同時測定益腎衍嗣丸中4種成分的含量

肖保國（駐馬店市第二中醫(yī)院藥劑科，河南駐馬店 463000）

雙波長HPLC法同時測定益腎衍嗣丸中4種成分的含量

肖保國＊（駐馬店市第二中醫(yī)院藥劑科，河南駐馬店 463000）

目的：建立同時測定益腎衍嗣丸中阿魏酸、梓醇、大黃素和大黃素甲醚含量的方法。方法：采用雙波長高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil-C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（78∶22，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm（阿魏酸、大黃素和大黃素甲醚）、210 nm（梓醇），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：阿魏酸、梓醇、大黃素和大黃素甲醚檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.090 8～2.270 0 μg/mL（r＝0.999 9）、0.199 0～4.975 0 μg/mL（r＝0.999 3）、0.354 0～8.850 0 μg/mL（r＝0.999 9）、0.336 0～8.400 0 μg/mL（r＝0.999 7）；定量限分別為14.66、8.75、10.26、13.68 ng，檢測限分別為5.66、2.67、3.78、4.25 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為101.15%～102.73%（RSD＝0.58%，n＝6）、99.20%～101.69%（RSD＝1.20%，n＝6）、100.90%～101.36%（RSD＝0.16%，n＝6）、95.64%～98.96%（RSD＝1.49%，n＝6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，操作簡單，適用于益腎衍嗣丸中4種成分含量的同時測定。

高效液相色譜法；雙波長；益腎衍嗣丸；阿魏酸；梓醇；大黃素；大黃素甲醚；含量

益腎衍嗣丸為河南省駐馬店市第二中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由當(dāng)歸、熟地黃、制何首烏、黃芪、枸杞子、菟絲子、沙苑子、五味子、女貞子、山茱萸等中藥組成，具有補(bǔ)腎、助陽、生精的功效[1-5]。當(dāng)歸、地黃和何首烏為方中君藥，但目前尚未有同時測定該制劑中上述3種藥材中相關(guān)主要活性成分含量的報道。鑒于此，筆者采用雙波長高效液相色譜法（HPLC），建立了同時測定該制劑中當(dāng)歸的主要活性成分阿魏酸[6-7]、地黃的主要活性成分梓醇[8-9]、何首烏的主要活性成分大黃素和大黃素甲醚[10-11]的含量，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1311C四元梯度泵帶真空脫氣機(jī)、G1329B標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器、G4212B二極管陣列檢測器、M8500AA色譜工作站（美國Agilent公司）；AG135型十萬分之一電子分析天平（瑞士Me-ttler-Toledo公司）；Synergy 185型超純水儀（美國Millipore公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

益腎衍嗣丸（河南省駐馬店市第二中醫(yī)院自制，批號：20161201、20161202、20161203，規(guī)格：1 g/丸）；阿魏酸對照品（批號：110773-201611，純度：＞99.0%）、梓醇對照品（批號：110808-201601，純度：＞99.0%）、大黃素對照品（批號：110756-201110，純度：＞98.7%）、大黃素甲醚對照品（批號：110789-201611，純度：＞99.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（78∶22，V/V）；流速：1.0mL/min；檢測波長：280 nm（阿魏酸、大黃素和大黃素甲醚）、210 nm（梓醇）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取阿魏酸、梓醇、大黃素、大黃素甲醚對照品分別為 9.08、9.95、8.85、8.40 mg，各置于10、10、5、5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得單一對照品貯備液。取上述阿魏酸、梓醇、大黃素、大黃素甲醚單一對照品貯備液各0.5、1、1、1 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加75%甲醇溶液50 mL，于50℃溫浸 2 h，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，濾過，重復(fù)提取2次，合并提取液，減壓回收溶劑至干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例，制備不含當(dāng)歸、地黃和何首烏的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分峰與其他相鄰峰均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以阿魏酸峰計為10 000，保留時間為35.1 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD。結(jié)果，阿魏酸、梓醇、大黃素和大黃素甲醚的LOQ分別為 14.66、8.75、10.26、13.68 ng，LOD 分別為 5.66、2.67、3.78、4.25 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，阿魏酸、梓醇、大黃素和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.26%、1.17%、0.36%、1.43%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20161201）適量，分別于室溫下避光放置 0、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，阿魏酸、梓醇、大黃素和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為 1.20%、0.39%、1.27%、1.17%（n＝10），表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 高效液相色譜圖A1.mixed control（210 nm）；A2.mixed control（280 nm）；B1.test sample（210 nm）；B2.test sample（210 nm）；C1.negative control（210 nm）；C2.negative control（280 nm）；1.catalpol；2.emodin；3.ferulic acid；4.emodin methyletherFig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.8 重復(fù)性試驗

取樣品粉末（批號：20161201）6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸、梓醇、大黃素和大黃素甲醚含量的平均值分別為0.111 8、0.266 9、0.428 2、0.424 3 mg/g，RSD 分別為1.89%、0.82%、1.81%、1.53%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品粉末（批號：20161201）適量，共6份，每份約1.0 g，精密稱定，分別置于100 mL量瓶中，各加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品粉末各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，梓醇在210 nm波長處有最大吸收，阿魏酸、大黃素和大黃素甲醚在280 nm波長處有最大吸收，故本試驗采用上述兩種波長進(jìn)行試驗。

3.2 流動相的考察

筆者考察了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.2%醋酸銨、甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相時的色譜情況。綜合考慮保留時間、峰形、分離度等，最終確定本試驗的流動相為定甲醇-0.1%磷酸溶液（78∶22，V/V）。

3.3 提取溶劑及提取時間的考察

本試驗比較了水、50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇為提取溶劑時的提取效果，結(jié)果75%甲醇溶液提取效果最佳。因此，選擇75%甲醇溶液為提取溶劑。同時，還考察了超聲提取時間（15、30、60 min），結(jié)果表明，30 min與60 min時樣品提取效果基本相似，為節(jié)約試驗時間，最終選擇超聲時間為30 min。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確可靠，操作簡單，適用于益腎衍嗣丸中4種成分含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 4 Kinds of Components in Yishen Yansi Pills by Double Wavelength HPLC

XIAO Baoguo（Dept.of Pharmacy，Zhumadian Second Hospital of TCM，Henan Zhumadian 463000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of ferulic acid，catalpol，emodin and emodin methylether in Yishen yansi pills.METHODS：Double wavelength HPLC method was adopted.The separation was performed on Kromasil-C18column with mobile phase methanol-0.1%phosphate solution（78∶22，V/V）at flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 210 nm for catalpol，280 nm for ferulic acid，emodin and emodin methylether.The column temperature was 30 ℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.090 8-2.270 0 μg/mL for ferulic acid（r＝0.999 9），0.199 0-4.975 0 μg/mL for catalpol（r＝0.999 3），0.354 0-8.850 0 μg/mL for emodin（r＝0.999 9），0.336 0～8.400 0 μg/mL for emodin methylether（r＝0.999 7），respectively.The limits of quantitation were 14.66，8.75，10.26，13.68 ng，and the limits of detection were 5.66，2.67，3.78，4.25 ng，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%.The recoveries were 101.15%-102.73%（RSD＝0.58%，n＝6），99.20%-101.69%（RSD＝1.20%，n＝6），100.90%-101.36%（RSD＝0.16%，n＝6），95.64%-98.96%（RSD＝1.49%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable，simple and suitable for simultaneous determination of 4 kinds of components in Yishen yansi pills.

HPLC；Double wavelength；Yishen yansi pills；Ferulic acid；Catalpol；Emodin；Emodin methylether；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4735-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.35

＊主管藥師。研究方向：藥劑學(xué)。電話：0523-86201292。E-mail：403509636@qq.com

（編輯：劉 柳）

2017-04-26

2017-06-23）