火把花根片中間體的HPLC指紋圖譜研究Δ

鄭丁丁，張小梅，楊怡，陳一龍，勵(lì)娜，姚媛媛，楊大堅(jiān)#（.重慶市中藥研究院，重慶400065；.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 40075）

火把花根片中間體的HPLC指紋圖譜研究Δ

鄭丁丁1，2＊，張小梅1，楊怡2，陳一龍1，勵(lì)娜1，姚媛媛1，楊大堅(jiān)1#（1.重慶市中藥研究院，重慶400065；2.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）

目的：建立火把花根片中間體的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為用Inertsil ODS-4，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.75 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以雷公藤晉堿為參照，測定10批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評價(jià)。結(jié)果：10批火把花根片中間體的HPLC圖譜有25個(gè)共有峰，相似度均＞0.90。經(jīng)驗(yàn)證，10批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為火把花根片中間體的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

火把花根片；中間體；高效液相色譜法；指紋圖譜

昆明山海棠為衛(wèi)矛科植物昆明山海棠Tripterygiumhypoglaucum（Levl.）Hutch的干燥根[1]，始載于《本草綱目》，又名紫荊皮、紫金皮、火把花等，具有祛風(fēng)除濕、祛瘀通絡(luò)、續(xù)筋接骨之功效，有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤及抗人類免疫缺陷病毒等藥理作用[2]，主要成分為生物堿和萜類等[3-6]?；鸢鸦ǜ虚g體是以昆明山海棠去皮的根芯為單一原料，經(jīng)水煎醇沉工藝所制得，其成品火把花根片是其中間體與輔料按特定比例混合壓片而成的中藥制劑，臨床上用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎和紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，效果良好[4-5]。

高效液相色譜法（HPLC）具有分離效能高、選擇性好、檢測靈敏高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已成為常用的中藥HPLC指紋圖譜研究方法。中藥HPLC圖譜所反映的是中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，在判斷中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣、控制中藥原材料、中間體和成品的質(zhì)量，以及衡量批間差異性等方面起到重要的作用[6]。火把花根片中間體是火把花根片成型前的重要環(huán)節(jié)，其藥材昆明山海棠所含的雷公藤甲素、雷公藤紅素既是有效成分又是毒性成分[7-10]，中間體的質(zhì)量及提取工藝的穩(wěn)定是保證制劑臨床用藥安全有效的前提。本研究擬對火把花根片中間體建立HPLC指紋圖譜，完善其中間體的質(zhì)量評價(jià)體系，為保證火把花根片質(zhì)量穩(wěn)定、臨床用藥安全有效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1311B四元泵、G1329B進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314FVWD檢測器、Agilent色譜工作站（美國Agilent公司）；AEG-45SM型十萬分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；BP121S型萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器、HH-2KYY型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑

火把花根片大生產(chǎn)中間體（編號：S1～S3）、自制火把花根片中間體（編號：S4～S10）均由重慶市藥研院制藥有限公司提供；沒食子兒茶素對照品（批號：FY10540924）、表沒食子兒茶素對照品（批號：FY10510801）、兒茶素對照品（批號：FY10480928）、雷公藤晉堿對照品（批號：140925）、雷公藤次堿對照品（批號：150623）均購自成都普菲德生物科技有限公司，純度均≥98.0%；表兒茶素對照品（南京景竹生物科技有限公司，批號：14082007，純度：≥98.0%）；雷公藤堿庚對照品（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所自制，質(zhì)譜檢測確證結(jié)構(gòu)，HPLC檢測純度≥98.0%）；去甲澤拉木醛對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-14061002，純度：≥98%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-4（250 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，10%→20%A；5～25 min，20%→24%A；25～30 min，24%→30%A；30～55 min，30%→40%A；55～70 min，40%→41%A；70～85 min，41%→42%A；85～100 min，42%→48%A；100～105 min，48%→53%A；105～110 min，53%→58%A；110～135 min，58%→85%A；135～150 min，85%→90%A；150～165 min，90%A）；流速：0.75 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品各適量，加甲醇制成沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、雷公藤晉堿、雷公藤堿庚、雷公藤次堿、去甲澤拉木醛質(zhì)量濃度分別為0.007 5、0.006 8、0.028 8、0.010 1、0.077 6、0.006 1、0.060 5、0.003 1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末（過3號篩）2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯40 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理40 min，冷卻，濾過，精密加水振搖提取2次，每次40 mL；合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S1）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以雷公藤晉堿的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，25個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.2%（n＝6），相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以雷公藤晉堿峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，25個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜0.12%（n＝6），相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以雷公藤晉堿峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，25個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜1.5%（n＝6），相對峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成及相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，以S1樣品為參照圖譜，時(shí)間窗寬度為0.10 min，采用中位數(shù)矢量法并多點(diǎn)矯正后自動匹配，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖1 10批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC overlay fingerprints of 10 batches of samples

圖2 樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of samples

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，10批樣品（S1～S10）相似度均＞0.9，表明10批樣品質(zhì)量穩(wěn)定，詳見表1。

表1 10批樣品相似度評價(jià)結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of 10 batches of samples

2.4.3 共有峰相關(guān)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。10批樣品有25個(gè)共有峰，其中1號峰為沒食子兒茶素，2號峰為表沒食子兒茶素，3號峰為兒茶素，4號峰為表兒茶素，12號峰為雷公藤晉堿，13號峰為雷公藤堿庚，15號峰為雷公藤次堿，22號峰為去甲澤拉木醛；由于雷公藤晉堿出峰時(shí)間居中且穩(wěn)定，與相鄰峰分離較好，因此選擇12號峰（雷公藤晉堿）作為參照峰計(jì)算其他共有峰相對于12號峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，詳見表2、表3。

表2 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時(shí)間Tab 2 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

3 討論

3.1 供試品制備方法的選擇

本試驗(yàn)考察了甲醇提取、乙酸乙酯提取、乙酸乙酯提取-水萃取2次、乙酸乙酯提取-水萃取3次等處理方法，以及不同提取時(shí)間（20、30、40、50 min），不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30）對結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以乙酸乙酯提取-水萃取3次（料液比1∶10）超聲提取40 min時(shí)提取效果最佳，待測成分圖譜基線平穩(wěn)，峰形較好。

表3 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples

3.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)在已有基礎(chǔ)上選擇了色譜柱Inertsil ODS-4（250 mm×4.6 mm，3 μm）[11-13]，考察了乙腈-水、乙腈-0.4%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸等流動相，以及216、220、260 nm檢測波長對結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相、檢測波長為220 nm時(shí)待測成分色譜圖基線平穩(wěn)且峰形較好。

3.3 火把花根片中間體質(zhì)量的思考

火把花根片是雷公藤制劑中毒性最小、療效確切的中藥免疫抑制劑的代表。在其中間體的控制上，目前仍沒有明確標(biāo)準(zhǔn)，僅憑經(jīng)驗(yàn)判別和依靠半數(shù)致死量（LD50）來判斷其毒副作用，致使產(chǎn)品在一定程度上存在潛在的不穩(wěn)定因素。同時(shí)作為雷公藤制劑，其工藝穩(wěn)定對保障制劑的安全有效顯得尤其重要。因此，本試驗(yàn)選擇對既能體現(xiàn)藥材質(zhì)量，又能保障成品質(zhì)量的中間體進(jìn)行整體性質(zhì)量控制研究。

本試驗(yàn)所構(gòu)建的火把花根片中間體HPLC指紋圖譜有25個(gè)共有峰，且10批樣品相似度均＞0.90，表明各批次間工藝較穩(wěn)定。本研究通過對中間體以HPLC指紋圖譜的整體性來進(jìn)行質(zhì)量控制，達(dá)到了控制火把花根片中間體提取過程中可能影響產(chǎn)品質(zhì)量因素的目的，完善了火把花根片中間體的質(zhì)量評價(jià)體系，保證了終產(chǎn)品質(zhì)量，可為臨床用藥安全性和療效穩(wěn)定性提供可靠依據(jù)。

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Study on HPLC Fingerprints of Huobahuagen Tablets Intermediate

ZHENG Dingding1，2，ZHANG Xiaomei1，YANG Yi2，CHEN Yilong1，LI Na1，YAO Yuanyuan1，YANG Dajian1（1.Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400065，China；2.College of Pharmacy，Southwest University，Chongqing 400715，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprints for Huobahuagen tablets intermediate.METHODS：HPLC was performed on Inertsil ODS-4 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 0.75 mL/min.The detection wavelength was set at 220 nm，and column temperature was 30℃.The sample size was 10 μL.Using wilforgine as reference，HPLC chromatograms of 10 batches of samples were determined.Common peak identification and similarity evaluation were performed by using Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprint（2004 A edition）.RESULTS：There were 25 common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples，and similarity degrees were higher than 0.9.After validated，HPLC chromatograms of 10 batches of samples were in good agreement with control fingerprints.CONCLUSIONS：The established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of Huobahuagen tablets intermediate.

Huobahuagen tablets；Intermediate；HPLC；Fingerprint

R284

A

1001-0408（2017）33-4714-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.29

重慶市應(yīng)用開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No.cstc2014yykfC10005）

＊碩士研究生。研究方向：中藥學(xué)。E-mail：1563472460@qq.com

#通信作者：研究員，博士。研究方向：中藥品種及品質(zhì)。電話：023-89029081。E-mail：yangdajian@foxmail.com

（編輯：張 靜）

2017-03-23

2017-05-18）