HPLC法同時測定青娥丸中7種成分的含量

王向鋒，黃小為，劉明霞，朱玉青（.郯城縣第一人民醫(yī)院，山東臨沂7600；.山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂 7607）

HPLC法同時測定青娥丸中7種成分的含量

王向鋒1＊，黃小為1，劉明霞2，朱玉青2（1.郯城縣第一人民醫(yī)院，山東臨沂276100；2.山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，山東臨沂 276017）

目的：建立同時測定青娥丸中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kinetex-C18，流動相為甲醇-0.1%乙酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為248 nm，柱溫為30℃ ，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.012～101.2 μg/mL（r＝0.999 9）、1.007～100.7 μg/mL（r＝0.999 7）、1.010～101.0 μg/mL（r＝0.999 9）、1.021～102.1 μg/mL（r＝0.999 9）、1.002～100.2 μg/mL（r＝0.999 6）、1.008～100.8 μg/mL（r＝0.999 9）、1.025～102.5 μg/mL（r＝0.999 8）；定量限分別為0.15、0.15、0.30、0.30、0.15、0.30、0.30 μg/mL，檢測限分別為0.05、0.05、0.10、0.10、0.05、0.10、0.10 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為95.3%～99.6%（RSD＝1.9%，n＝6）、96.1%～99.3%（RSD＝1.2%，n＝6）、95.2%～98.4%（RSD＝1.4%，n＝6）、95.4%～99.2%（RSD＝1.5%，n＝6）、96.1%～99.3%（RSD＝1.5%，n＝6）、95.6%～98.9%（RSD＝1.4%，n＝6）、95.2%～99.6%（RSD＝1.6%，n＝6）。結(jié)論：該方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于青娥丸中7種成分含量的同時測定。

高效液相色譜法；青娥丸；含量；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；佛手柑內(nèi)酯；歐前胡素；三甲基補(bǔ)骨脂素；新補(bǔ)骨脂異黃酮；補(bǔ)骨脂二氫黃酮

青娥丸具有補(bǔ)腎強(qiáng)腰的作用，主要用于腎虛腰痛、起坐不利、膝軟乏力等癥的治療[1]；由鹽杜仲、鹽補(bǔ)骨脂、大蒜（蒸熟粉碎成細(xì)粉）、核桃仁（炒后搗爛）4味中藥組成[2-3]。鹽補(bǔ)骨脂作為青娥丸的主要配方之一，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效[4-7]。補(bǔ)骨脂中主要含有呋喃香豆素類、黃酮類、萜酚類成分[8-9]。青娥丸收載于2015年版《中國藥典》（一部），其含量測定項中僅對補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素兩種呋喃香豆素類成分進(jìn)行測定[1]，并沒有對其他功效成分進(jìn)行控制；且現(xiàn)有關(guān)于測定青娥丸的文獻(xiàn)多為單一成分報道[10-12]。鑒于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定青娥丸呋喃香豆素類成分（補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素）和黃酮類成分（新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮）的含量，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1329B自動進(jìn)樣器、G1315D二極管陣列檢測器、G1311C四元梯度洗脫泵、G1316A柱溫箱、1260色譜工作站（美國Agilent公司）；XP205型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q型純化水儀（美國Millipore公司）；D101大孔吸附樹脂（上海摩速科學(xué)器材有限公司）。

1.2 藥品與試劑

青娥丸（南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：160301、160302、160303，規(guī)格：9 g/丸）；補(bǔ)骨脂素對照品（批號：110739-201617，純度：99.7%）、異補(bǔ)骨脂素對照品（批號：110738-201614，純度：99.9%）、佛手柑內(nèi)酯對照品（批號：520036-201401，純度：99.2%）、歐前胡素對照品（批號：110826-201616，純度：99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院；三甲基補(bǔ)骨脂素對照品（東京化成工業(yè)株式會社，批號：TYTUI-JF，純度：98.0%）；新補(bǔ)骨脂異黃酮對照品（批號：150528，純度：98.0%）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮對照品（批號：150415，純度：98.0%）均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；甲醇為色譜純，乙酸為優(yōu)級純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%乙酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：248 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取待測成分對照品各適量，精密稱定，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇-0.1%乙酸溶液（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，制成補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮質(zhì)量濃度分別為1.012、1.007、1.010、1.021、1.002、1.008、1.025 mg/mL的混合對照品貯備液。取上述混合對照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇-0.1%乙酸溶液（1∶1，V/V）定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研碎，精密稱取約4.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑為1.7 cm，柱高為15 cm），用30%乙醇溶液70 mL洗脫，棄去洗脫液，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇-0.1%乙酸溶液（1∶1，V/V）50 mL使溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對照溶液 取甲醇-0.1%乙酸溶液（1∶1，V/V）適量為空白對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以補(bǔ)骨脂素峰計為7 000，保留時間為7.2 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾[13-14]。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇-0.1%乙酸溶液（1∶1，V/V）定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表2。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD，結(jié)果見表3。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮峰面積的RSD分別為0.35%、0.38%、0.22%、0.56%、0.18%、0.47%、0.55%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

表3LOQ與LOD測定結(jié)果（μg/mL）Tab 3 Results of LOD and LOQ（μg/mL）

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：160301）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮峰面積的RSD分別為0.74%、0.82%、0.62%、0.75%、0.84%、0.62%、0.85%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：160301）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮的含量平均值分別為0.811、0.746、0.647、0.650、0.774 、0.226 、0.368 mg/g；RSD分別為1.55%、1.21%、1.76%、1.65%、1.38%、1.52%、1.05%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取同一批己知含量的樣品（批號：160301）約2.0 g，共6份，各置于250 mL圓底燒瓶中，分別精密加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 樣品提取方法的優(yōu)點

本試驗采用D101型大孔吸附樹脂對樣品進(jìn)行富集處理，D101型大孔吸附樹脂可對補(bǔ)骨脂中的呋喃香豆素類和黃酮類成分具有較強(qiáng)的吸附能力，采用30%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，可以將樣品中極性較強(qiáng)的成分去除；然后采用乙醇進(jìn)行洗脫，收集乙醇洗脫液，進(jìn)行濃縮富集，有助于保護(hù)色譜柱和排除其他成分的干擾。此外，對樣品進(jìn)行富集，還有助于提高樣品中微量成分的檢出率。

表5 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.2 流動相的考察

本試驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相時進(jìn)行梯度洗脫的色譜情況。結(jié)果，采用甲醇-水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，色譜峰拖尾較為嚴(yán)重，且分離度不好；以甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，歐前胡素、三甲基補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮與補(bǔ)骨脂二氫黃酮之間的分離度較差；以甲醇-0.1%乙酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，待測成分均能較好分離。因此，選擇甲醇-0.1%乙酸溶液為本試驗的流動相。

3.3 檢測波長的考察

筆者采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)待測成分在248 nm波長處均具有較強(qiáng)的紫外吸收，因此選擇248 nm作為檢測波長。

3.4 結(jié)果分析

2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素兩種成分的總量應(yīng)不得少于1.2 mg/g，但沒有規(guī)定其他成分的含量。本試驗測定結(jié)果中，補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素兩種成分的總量均能符合《中國藥典》的規(guī)定。通過對3批樣品進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)批次之間各成分的含量基本一致，說明企業(yè)的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，批次之間樣品的差異較小。

綜上所述，本方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于青娥丸中7種成分含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 7 Kinds of Components in Qing’e Pills by HPLC

WANG Xiangfeng1，HUANG Xiaowei1，LIU Mingxia2，ZHU Yuqing2（1.Tancheng County First People’s Hospital，Shandong Linyi 276100，China；2.Shandong Luoxin Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Shandong Linyi 276017，China）

OBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of psoralen，isopsoralen，bergapten，imperatorin，trimethylpsorale，neobavaisoflavone and bavachin in Qing’e pills.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Kinetex-C18column with mobile phase consisted of methanol-0.1%glacial acetic（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 248 nm.The column temperature was 30℃ .The sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges were 1.012-101.2 μg/mL for psoralen（r＝0.999 9），1.007-100.7 μg/mL for isopsoralen（r＝0.999 7），1.010-101.0 μg/mL for bergapten（r＝0.999 9），1.021-102.1 μg/mL for imperatorin（r＝0.999 9），1.002-100.2 μg/mL for trimethylpsorale（r＝0.999 6），1.008-100.8 μg/mL for neobavaisoflavone（r＝0.999 9），1.025-102.5 μg/mL for bavachin（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantitation were 0.15，0.15，0.30，0.30，0.15，0.30，0.30 μg/mL，and the limits of detection were 0.05，0.05，0.10，0.10，0.05，0.10，0.10 μg/mL，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%.The recoveries were 95.3%-99.6%（RSD＝1.9%，n＝6），96.1%-99.3%（RSD＝1.2%，n＝6），95.2%-98.4%（RSD＝1.4%，n＝6），95.4%-99.2%（RSD＝1.5%，n＝6），96.1%-99.3%（RSD＝1.5%，n＝6），95.6%-98.9%（RSD＝1.4%，n＝6），95.2%-99.6%（RSD＝1.6%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，can be used for simultaneous determination of 7 kinds of components in Qing’e pills.

HPLC；Qing’e pills；Content；Psoralen；Isopsoralen；Bergapten；Imperatorin；Trimethylpsorale；Neobavaisoflavone；Bavachin

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4728-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.33

＊主管藥師。研究方向：醫(yī)藥研發(fā)及管理。E-mail：wxf279@163.com

（編輯：劉 柳）

2017-04-18

2017-06-28）