狹葉紅景天種子萌發(fā)和愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)條件篩選

， ， ， ， ， (.成都大學四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 6005；.成都大學藥學與生物工程學院， 四川 成都 6006)

狹葉紅景天種子萌發(fā)和愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)條件篩選

劉洪明1，王躍華2，陳沙2，甘曉慧2，劉鑫2，彭梅2
(1.成都大學四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052；2.成都大學藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

[目的]以狹葉紅景天種子為實驗材料，探索其種子萌發(fā)和愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)條件。[方法]通過對狹葉紅景天種子不同浸泡時間和消毒時間的篩選，獲得種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)條件；并進一步選取狹葉紅景天的無菌苗的幼葉為外植體，采用不同植物激素的配比進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，最終篩選出狹葉紅景天愈傷組織誘導培養(yǎng)的最佳條件。[結果]狹葉紅景天種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)方式為將未經(jīng)浸泡的種子，先采用酒精消毒20 s后再經(jīng)升汞消毒20 min，其種子的染菌率為0%，萌發(fā)率為(61.8±0.21)%；狹葉紅景天幼葉誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 3 mg/L+KT 0.1 mg/L，在培養(yǎng)30 d后愈傷組織誘導率可達98%以上。

狹葉紅景天； 種子； 無菌苗； 愈傷組織

狹葉紅景天(Rhodiolakirilowii(Regel) Maxim)又名獅子七、獅子草、九頭獅子七、澀疙瘩，為景天科紅景天屬多年生草本植物，生于海拔2 000～5 600 m的山地多石草地或石坡上，主產(chǎn)于我國西藏、云南、四川、新疆、青海、甘肅、陜西、山西、河北等省，緬甸也有分布[1]，是珍稀藥用植物之一。狹葉紅景天根莖可藥用，具有活血調(diào)經(jīng)，清肺養(yǎng)胃，止血止痢等功效[2]。最近研究表明，狹葉紅景天還具有預防高原反應、活血化瘀、提高耐缺氧能力、輻射保護等作用[3-6]，此外，狹葉紅景天提取物還可以預防和延緩衰老、抗菌和增強免疫力的功效[7-9]。

近年來，由于狹葉紅景天功效突出、工業(yè)化程度高，經(jīng)濟效益和社會效益十分顯著，國內(nèi)外競相開發(fā)利用；加之其生長條件惡劣、自然繁育難，自然條件下萌發(fā)率僅為11.3%[10]，自然繁殖率極低，而連年的無序開發(fā)，導致有限的資源逐年減少,甚至瀕危，這些都極大的制約了其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)化開發(fā)利用。為解決這一難題,本研究采用生物工程技術，以狹葉紅景天種子為對象進行了無菌苗培養(yǎng)和愈傷組織誘導研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

狹葉紅景天種子采自四川省阿壩州紅原縣，經(jīng)鑒定為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)植物狹葉紅景天(Rhodiolakirilowii(Regel) Maxim)的種子。

1.2 方 法

1.2.1 種子消毒方法

將種子從果實中取出后，篩選粒大飽滿的種子，用無菌水于5 ℃冰箱中浸泡8 h。在超凈工作臺上，先用70%酒精消毒20 s后，再用升汞分別處理A1(0 min)、A2(10 min)、A3(20 min)，最后用無菌水沖洗干凈后，接入MS的基本培養(yǎng)基中進行種子萌發(fā)培養(yǎng)，本實驗重復3次。

1.2.2 種子浸泡方法

將篩選好的種子分裝于5 mL的滅菌離心管中，用無菌注射器注入約3 mL無菌水，放于5 ℃冰箱中進行浸泡，浸泡過程中每隔1 h搖動1次，浸泡時間分別為B1(0 h)、B2(8 h)、B3(12 h)，每4 h更換1次無菌水。浸泡結束后，按照1.2.1中消毒方式升汞消毒20 min，處理完畢后接種于MS基本培養(yǎng)基中,上述實驗重復3次。

1.2.3 愈傷組織誘導

待上述種子萌發(fā)、生長后，在超凈工作臺上取出無菌苗，切取幼葉接入由不同激素配比設計的L16(44)正交實驗中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，并進一步研究由6-BA、2,4-D和KT 3種激素不同組合對其愈傷組織誘導的影響(見表1)。

1.2.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

種子萌發(fā)和愈傷組織誘導所用的MS基本培養(yǎng)基中蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH調(diào)至5.8；培養(yǎng)條件為溫度20 ℃、光照24 h和光照強度2 000 lx。

表1 因素水平

水平 A 6?BA(mg/L) B 2，4?D(mg/L) C KT(mg/L)100020．310．130．520．240．730．3

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)處理由Excel 2007和正交設計助手ⅡV 3.1完成。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對種子萌發(fā)的影響

利用升汞消毒是植物組織培養(yǎng)過程中的常見方法，本實驗設計3種不同消毒時間和空白對照對狹葉紅景天種子升汞消毒實際進行考察，將消毒后種子接種于MS基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 d統(tǒng)計結果見表2。

表2 不同消毒時間對狹葉紅景天種子萌發(fā)的影響

實驗編號消毒時間(min)萌發(fā)率(%)(X±S，n=3)染菌率(%)(X±S，n=3)幼苗生長狀況X103．5±2．68100很快染菌，僅有極少數(shù)能長出子葉。X21067．3±1．3213±3．61種子萌發(fā)快，幼苗胚軸為淺綠色，根尖有紅色物質，生長良好。X32061．8±0．210種子萌發(fā)較快，幼苗胚軸為淺綠色，根尖有紅色物質，生長良好。X43039．9±0．140種子萌發(fā)時間長，幼苗胚軸為綠白色，僅少數(shù)為淺綠色，生長不良。

注：12 d后統(tǒng)計結果。表3同。

從表2可看出，升汞消毒時間對狹葉紅景天種子在無菌條件下的萌發(fā)率、染菌率和萌發(fā)時間都有明顯的影響，與楊云貴[11]等報道升汞消毒對高羊茅種子萌發(fā)率影響不大的結論不一致，分析原因可能是不同種子對升汞的抗性存在差異。實驗結果顯示，不使用升汞消毒時，種子染菌情況嚴重，僅有極少數(shù)種子在染菌前萌發(fā)，染菌后死亡。這主要由于狹葉紅景天種子體積小，染菌嚴重影響了種子萌發(fā)，出現(xiàn)染菌后，種子很快就死亡。隨著升汞消毒時間的增加，染菌率降低，種子萌發(fā)率也逐步降低。當消毒10 min時，種子最高萌發(fā)率(67.3±1.32)%，但有(13±3.61)%存在染菌情況。消毒時間增加到20 min時，種子萌發(fā)率較高，為(61.8±0.21)%，且種子不存在染菌情況。消毒時間繼續(xù)增加到30 min，種子雖然未染菌，但萌發(fā)率僅為(39.9±0.14)%，說明消毒30 min對狹葉紅景天種子的種胚造成了嚴重傷害，最終大大地降低了萌發(fā)率。綜上，選擇消毒20 min的A3處理作為最佳升汞消毒時間。

2.2 不同浸泡時間對種子萌發(fā)的影響

浸種可使種子提前吸收發(fā)芽所需要的水分，有利于種子快速萌發(fā)和打破休眠[12]，通常種子無菌萌發(fā)是采用先消毒后浸泡的方式，但此方法在種子浸泡過程中易染菌，且密閉浸泡又不能保證種子呼吸作用的需氧量。故本實驗選擇現(xiàn)將種子浸泡后再進行消毒的方式，篩選狹葉紅景天種子無菌萌發(fā)前的浸泡時間，可降低缺氧對種子造成的危害。處理后種子接于MS基本培養(yǎng)基中，12 d后統(tǒng)計結果見表3。

表3 不同浸泡時間對狹葉紅景天種子萌發(fā)的影響

實驗編號消毒時間(min)萌發(fā)率(%)(X±S，n=3)Y1078．84±2．59Y2867．33±4．73Y31235．18±6．29

從表3可看出，狹葉紅景天種子隨浸泡時間增加，萌發(fā)率逐步降低。種子不經(jīng)過浸泡萌發(fā)率最高，為(78.84±2.59)%；其次為浸泡8 h，萌發(fā)率為(67.33±4.73)%；浸泡12 h萌發(fā)率最低，僅為(35.18±6.29)%。這一結果與普通種子萌發(fā)實驗結論不同，筆者認為原因可能有2點： 1)實驗所用狹葉紅景天種子未經(jīng)過嚴格干燥處理，種子本身含水量較高，不需要吸收更多水分； 2)種子經(jīng)過較長時間的浸泡后，種子內(nèi)部會出現(xiàn)嚴重的缺氧，也會影響其種子的萌發(fā)。

2.3 愈傷組織誘導結果

愈傷組織誘導是植物生物技術育苗的重要步驟，本實驗選用了細胞分裂素6-BA和2種細胞生長素KT、2,4-D相互配比進行正交實驗，優(yōu)選最佳激素配比，提高愈傷組織誘導率，外植體培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計結果，見表4、表5。

實驗設計了16種愈傷組織誘導培養(yǎng)基，通過對整個誘導過程中愈傷組織誘導和生長情況觀察，接種后第6天，便有部分外植體葉柄基部開始愈傷化；第14天可觀察到長出的愈傷組織；第25天愈傷組織的誘導率較之前2 d已無變化。，實驗中可觀察到6種形態(tài)各異的愈傷組織。從愈傷組織致密程度和增殖情況來看，有3種最為典型，以2號(A1B2C2)綠色的顆粒狀愈傷組織最為致密，但增殖速度較慢見圖1 A；最為疏松的是5號(A2B1C2)，產(chǎn)生的黃綠色愈傷組織，增殖速度最慢(見圖1 B)；12號(A3B4C2)所形成的白綠色愈傷組織緊密程度處于二者之間，增殖速度最快(見圖1 C)。

圖1 愈傷組織形態(tài)圖

表4 愈傷組織誘導直觀分析表

實驗編號因素ABC誤差愈傷組織誘導率(%)(X±S，n=3)1111102122275．71±0．073133378．68±1．154144481．12±2．615212465．65±2．596221368．58±1．097234278．23±4．548243188．51±0．979313259．23±1．7110324188．90±2．8411331493．45±3．9612342398．34±1．4913414329．60±2．5514423439．04±1．2415432176．93±3．5716441282．02±0．62k10．5890．3860．6100．636k20．7520．6810．7920．738k30．8500．8180．6650．688k40．5700．8750．6950．699R0．2800．4890．1820．102

注：表中愈傷組織誘導率為接種后30 d統(tǒng)計結果。

對愈傷組織誘導率進行極差和方差分析，結果(表4、表5)發(fā)現(xiàn)，2,4-D對狹葉紅景天愈傷組織的誘導有很大的影響，效果達顯著水平，未達極顯著水平；6-BA的影響同樣為顯著水平，但不如2,4-D高；KT對愈傷組織誘導的影響不顯著。各因素對愈傷組織誘導率的影響作用依次為2,4-D濃度>6-BA濃度>KT濃度，本實驗得出最優(yōu)激素配比為A3B4C2，即MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 3 mg/L+KT 0.1 mg/L。正好為實驗設計的12號配方，實驗結果也表明，其愈傷組織誘導率和愈傷組織生長情況均為最優(yōu)。

表5 愈傷組織誘導方差分析

因素偏差平方和自由度F比F0．05F0．01顯著性A0．216310．2869．2829．5?B0．572327．2389．2829．5?C0．06933．2869．2829．5誤差0．023

3 討 論

眾所周知，外植體越幼嫩，誘導愈傷組織活性越強。為保證外植體的幼嫩，同時避免消毒劑對幼嫩外植體的損害，將種子消毒后，在無菌培養(yǎng)基上萌發(fā)，利用長出的無菌苗為外植體進行愈傷組織誘導研究。對種子前處理方式和愈傷組織誘導激素配比進行了探究試驗。

據(jù)報道，在常用的幾種消毒劑(次氯酸鈣、次氯酸鈉、過氧化氫、溴水、硝酸銀、升汞、抗生素)中，升汞的消毒效果最好[13]，而酒精可溶解種子表面的疏水性物質，增強升汞消毒作用，故本實驗選擇酒精和升汞作為消毒劑進行種子的消毒研究。當然，本實驗對消毒劑的選擇還不夠全面，狹葉紅景天種子消毒方式還有待進一步系統(tǒng)研究。

對于同一種植物，外植體脫分化形成愈傷組織不僅同外源激素有關，也同外植體本身的內(nèi)源性激素有關。采用外植體的部位不同，誘導愈傷組織的激素種類和水平也不相同，李建民等[14]采用狹葉紅景天頂芽進行愈傷組織誘導，培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+LH 300；李偉等[15]采用葉和莖為外植體，培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.3 mg/L，均取得了良好成效。本實驗采用了2,4-D、KT、6-BA 3種植物激素，對狹葉紅景天無菌苗的葉進行了愈傷組織的誘導，得出2,4-D對愈傷組織誘導率影響最為顯著，篩選出了最佳培養(yǎng)基配方。但對外植體種類篩選、多種激素考察、培養(yǎng)基配方篩選等，還應作進一步系統(tǒng)研究。

另外，實驗還對整個愈傷組織誘導過程進行了細致的觀察，發(fā)現(xiàn)不同初代愈傷組織的生長規(guī)律及其存在的多態(tài)性問題，主要表現(xiàn)在外部形態(tài)的不同和增殖能力的明顯差異。關于該問題，沙紅等[16]在對大花紅景天的研究中亦有提及。究其原因，筆者認為可進一步對不同形態(tài)的愈傷組織進行解剖學觀察，觀察不同生長期愈傷組織內(nèi)分布的分生細胞分化情況，探究其細胞水平上的分化過程。具體研究方法，還需進一步深入研究討論。

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Screening of the Best Callus Induction Culture Conditions and Seed Germination forRhodiolaKirilowii

LIUHongming1,WANGYuehua2,CHENSha2,GANXiaohui2,LIUXin2,PENGMei2

2017-02-28

四川省科技支撐計劃項目(2015 SZ 0034)。

劉洪明(1993—)，男，四川眉山人；在讀碩士研究生；研究方向：生藥學；E-mail:617211684@qq.com。

王躍華(1963—)，女，教授，碩士生導師，主要從事藥用植物生物技術研究；E-mail:1961689636@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.07.078

S 567.23+9

A

1001-4705(2017)07-0078-04