銀杏幼胚離體誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)研究

丁鐵玉

【摘? ?要】 該試驗(yàn)以銀杏幼胚作為外植體，以0.1%HgCl2溶液作為消毒劑，設(shè)置消毒時(shí)間為6min、8min、10min三個(gè)配比，采用4種不同配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方對銀杏幼胚進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)研究。通過比較不同消毒時(shí)間下銀杏幼胚的成活率、萌發(fā)率、污染率，及不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上銀杏幼胚萌發(fā)成苗的生長狀態(tài)，最后結(jié)果得出：幼胚使用0.1%HgCl2消毒8min最佳;MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA配方最有利于銀杏幼胚誘導(dǎo)。

【關(guān)鍵詞】 銀杏;幼胚;升汞;消毒時(shí)間;誘導(dǎo)培養(yǎng)

Study on in vitro induction culture of young embryos of ginkgo biloba l

Ding Tieyu

（Garden management office of? Tongyu county， Jilin province? ?137200）

[Abstract] In this experiment， young embryos of ginkgo biloba were used as explants， 0.1% HgCl2 solution was used as disinfectant， and three proportions of disinfection time were set as 6min， 8min and 10min. Four different proportions of induction medium formula were used for induction culture of young embryos of ginkgo biloba. By comparing the survival rate， germination rate and pollution rate of young embryos of ginkgo biloba under different disinfection time， as well as the growth status of young embryos germinating into seedlings on different induction medium， the final result was： young embryos were sterilized with 0.1% HgCl2 for 8min， which was the best. MS+ 1.0mg· l-1 6-ba +1.0mg· l-1 NAA formula is most favorable for induction of young embryos of ginkgo biloba.

[Keywords] ginkgo biloba; young embryo; mercuric chloride; disinfection time; induction training

銀杏，為銀杏科銀杏屬植物，拉丁學(xué)名為Ginkgo biloba.L，是我國非常著名的一種鄉(xiāng)土樹種，為中生代的一種孑遺植物，被稱為人類的活化石。該植物樹形端莊，姿態(tài)優(yōu)美，尤其葉子獨(dú)特秀雅，到秋季之后一片金黃，非常美觀，觀賞價(jià)值極高，在園林中應(yīng)用非常廣泛，可以作為行道樹、獨(dú)賞樹、林叢樹等多用綠化應(yīng)用。銀杏常用的繁殖方法為播種繁殖，但由于其種子成熟特殊，為生理后熟，導(dǎo)致播種期延后，另外由于種皮較厚不容易發(fā)芽，播種繁殖需要提前進(jìn)行長時(shí)間的層積催芽，這些均影響到了銀杏的繁殖速度。因此本實(shí)驗(yàn)嘗試以其幼胚為原材料，研究其離體誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)，由于整個(gè)離體培養(yǎng)過程復(fù)雜，該試驗(yàn)主要針對誘導(dǎo)階段進(jìn)行具體研究，以為整個(gè)銀杏的離體培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

本次試驗(yàn)開始于2018年4月～2019年4月，銀杏種子購買于江蘇省沭陽縣新河鎮(zhèn)好心情園藝基地。試驗(yàn)藥品有：MS大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分所需各種藥品，瓊脂，NAA、6-BA等生長激素，次氯酸鈉、升汞、75%酒精等消毒劑，98%濃硫酸、無菌水等;試驗(yàn)儀器有：高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、超凈工作臺、電子天平、電磁爐、不鋼鍋、培養(yǎng)箱等。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1外植體接種方法? 銀杏種子用清水沖洗30min，然后將種子放入燒杯中，加入98%濃硫酸，進(jìn)行浸泡，時(shí)間為2h，期間每隔10min，用玻璃棒進(jìn)行攪動(dòng)一次，直至銀杏種子外皮基本被腐蝕。倒掉濃硫酸，用清水進(jìn)行沖洗，時(shí)間為30min。在超凈臺內(nèi)，在盛有種子的燒杯中加入75%酒精浸泡30s，然后用無菌水沖洗5次。用配備好的升汞消毒溶液（0.1%HgCl2）對其進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分三個(gè)梯度，分別設(shè)為6min、8min和10min，然后用無菌水對其沖洗8次。

接種時(shí)將種子放在經(jīng)過滅菌處理的鐵質(zhì)托盤中，用解剖刀和鑷子剝?nèi)ャy杏種子果皮，再沿著子葉中縫將其剝開，用攝子取出完整的幼胚，小心地去除附著在幼胚表面上的白膜，不要破壞幼胚，然后將其放置在經(jīng)滅菌處理過的濾紙上。將處理好的幼胚接種到不同配比的培養(yǎng)基中，每瓶接種1粒，1個(gè)處理設(shè)為5瓶，重復(fù)3次。最后，封好封口膜，貼好標(biāo)簽，將其放置于環(huán)境適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔7d觀察生長狀況，并做好記錄。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比? 誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)為4個(gè)配比，分別為：Y1：MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA;Y2：MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA;Y3：MS+1.5mg·L-16-BA+1.5mg·L-1NAA;Y4：MS+2.0mg·L-16-BA+2.0mg·L-1NAA。

1.2.3 培養(yǎng)條件? 將接種后的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱濕度設(shè)置在80%。在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為（25±1）℃，光照強(qiáng)度設(shè)置為2000 Lx，每日光照時(shí)間設(shè)置為14 h。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 0.1%HgCl2三個(gè)消毒時(shí)間對銀杏幼胚的影響

幼胚接種25d后，統(tǒng)計(jì)各瓶中幼胚污染率、萌發(fā)率和成活率，具體結(jié)果如表1。由表1可以看出，隨著消毒時(shí)間的增加，污染率逐漸降低，但萌發(fā)率和成活率也不斷降低。當(dāng)消毒時(shí)間為6min時(shí)，成活率較高，為81.67%，但污染率也最高，為8.33%。當(dāng)消毒時(shí)間為8min時(shí)，成活率最高，為88.33%，污染率也較低，為3.33%。當(dāng)消毒時(shí)間為10min時(shí)，污染率最低，為0%，但成活率陡降，為68.33%。由此可見，幼胚的最佳消毒時(shí)間為8min。

2.2? 幼胚在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長情況

將處理好的幼胚接種至4種不同配方的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，各瓶中幼胚開始生長，在接種的第25 d后，統(tǒng)計(jì)各瓶中幼胚的生長情況，具體結(jié)果見表2。由表2看出，隨著植物激素6-BA和NAA含量的增加，幼胚的生根數(shù)和整體生長形態(tài)呈倒U型分布，這說明植物激素6-BA和NAA含量的增加并非一直有利于銀杏幼胚的生長。另外，幼胚莖由纖細(xì)到粗壯的變化，也說明了增加植物激素6-BA和NAA的比例會促進(jìn)幼胚莖的生長。但在此過程中，莖的長度與生長形態(tài)卻也隨之變矮和彎曲，導(dǎo)致畸形苗的產(chǎn)生。相比較之下，配方Y(jié)2（MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA）更適合作為幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方。

3? 結(jié)論與討論

通過觀察銀杏幼胚在三種不同消毒時(shí)間梯度處理過的生長形態(tài)，從中綜合對比出，將外植體消毒的最佳時(shí)間為8min;比較4種不同配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對幼胚的誘導(dǎo)生根狀況，得出配方MS+1.0mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA最有利于銀杏幼胚的初代誘導(dǎo)。此次試驗(yàn)對銀杏幼胚進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，雖然在個(gè)別幼胚根部發(fā)現(xiàn)有少量的愈傷組織，但大部分多是生長成為幼苗，和預(yù)想的試驗(yàn)結(jié)果存在一定偏差。因此，在對銀杏進(jìn)行離體繁殖時(shí)，還需對外植體的選擇、接種方法以及培養(yǎng)條件等做進(jìn)一步的研究。希望本次試驗(yàn)的結(jié)論可以為銀杏離體快繁技術(shù)提供一些依據(jù)，為今后深入研究銀杏組培試驗(yàn)提供有效的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且最終達(dá)成加速銀杏產(chǎn)業(yè)規(guī)?；绲哪繕?biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊增海.園藝植物組織培養(yǎng)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，? ? ? ? ? ? ? 1997：86.

[2] 崔 徽，桂耀林.經(jīng)濟(jì)植物的組織培養(yǎng)與快速繁殖[M].北? ? ? ?京：農(nóng)業(yè)出版社，2010：69-72.

[3] 王利民，周毅，陳龍友等.植物組織培養(yǎng)中消毒劑的運(yùn)? ? ? ? 用[J].貴州師大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，20（1）：? ? ? ? ? ? 14- 15.