響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝

張海燕，康三江*，曾朝珍，袁 晶，茍麗娜

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

沙棘是甘肅省的特色經(jīng)濟林資源之一，既是水土保持和防風(fēng)固沙的先驅(qū)植物，又為衛(wèi)生部頒布的第一批藥食同源資源[1]。沙棘的根、莖、葉、花、果，特別是沙棘果實含有豐富的維生素、有機酸、氨基酸、脂肪酸、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)和超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚、黃酮、三萜類及生物堿等生物活性物質(zhì)[2-3]，具有較高的營養(yǎng)保健作用和藥用價值[4-5]。目前，對沙棘資源的研究與開發(fā)逐漸深入，已從最初的水土保持的先鋒樹種轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袪I養(yǎng)價值和醫(yī)藥保健作用的經(jīng)濟林[6]，沙棘被廣泛應(yīng)用于高級飲料和保健產(chǎn)品的加工領(lǐng)域，發(fā)展?jié)摿薮骩7-9]。基于沙棘較高的保健作用和營養(yǎng)藥用價值，以及沙棘漿果能有效促進(jìn)益生菌生長和繁殖的特性[10]，利用微生物發(fā)酵沙棘制備沙棘酵素具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。

在“后疫情”、“大健康”時代背景下，“藥食同源”思想與“醫(yī)養(yǎng)結(jié)合”的理念相契合，追求健康成為消費者的首要訴求，使得功能性原料尤其是藥食同源原料備受追捧[11-12]。食用沙棘酵素作為一種由藥食同源食品沙棘經(jīng)微生物發(fā)酵制成的新型食品，富集了沙棘果實中的多酚、黃酮、有機酸等功能因子，具有營養(yǎng)、食療等功能[13]。沙棘酵素不僅含有原料自身的多種維生素、礦物質(zhì)和酶等營養(yǎng)物質(zhì)，還可通過復(fù)雜的物質(zhì)代謝，產(chǎn)生一些新的次生代謝物及生物活性成分，可有效預(yù)防與緩解人體的亞健康狀態(tài)，具有十分重要的科學(xué)意義與社會意義[14]。目前，沙棘酵素的研究多集中在發(fā)酵過程難以精準(zhǔn)控制的自然發(fā)酵方面，張浩然等[15]從微生物的角度闡述了沙棘酵素的代謝過程；金哲寧等[16]研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵沙棘酵素具有較好的體外抗氧化能力可能與其有機酸、游離氨基酸等功能性成分的協(xié)同作用有關(guān)；湯燦輝等[17]揭示了沙棘酵素發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)演變規(guī)律及自然發(fā)酵本質(zhì)，但自然發(fā)酵工藝因其發(fā)酵菌種龐雜，造成產(chǎn)品的品質(zhì)難以控制，因而利用特定微生物發(fā)酵加工食用沙棘酵素以提高其品質(zhì)和發(fā)酵過程可控性勢在必行。

有研究表明，植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發(fā)酵可顯著改善紅棗酒的揮發(fā)性風(fēng)味特征和感官品質(zhì)[18]，異常漢遜酵母（Hansenula anomala）可提高發(fā)酵產(chǎn)品的酶含量，同時產(chǎn)生的乙酸乙酯在改善食品風(fēng)味中起了一定作用[19]。因此，本研究以沙棘為原料，選擇釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）為發(fā)酵菌劑混菌發(fā)酵制備沙棘酵素，并通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝條件，為沙棘酵素的產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

沙棘果實：采自慶陽市華池縣，果實完好無損，約在10月中下旬采收；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Sc）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）（Ha）、植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）（Lp）：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸出粉、葡萄糖（均為生化試劑）：上海源葉生物科技有限公司；NaOH、福林酚、沒食子酸、苯酚、硫酸、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA·2Na）、鄰苯三酚（均為分析純）：陜西中瑞合成化學(xué)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RIGOL L3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：北京普源精電科技有限公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQLS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BL-2200H電子天平（精度0.01 g）：日本島津公司；CARY 100紫外-可見分光光度計：美國瓦里安有限公司；TGL-16LM高速冷凍離心機：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；MDF-U3386S超低溫冰箱：青島海爾集團(tuán)；DL-CJ-1N超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PB-10型精密pH計：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

酵母菌和植物乳植物桿菌分別以0.5%的接種量接種于50 mL的YPD、MRS培養(yǎng)基中，酵母菌于28 ℃條件下活化48～72 h，植物乳桿菌于37 ℃條件下活化24 h后，將它們傳代到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中獲得單菌落，單菌落再次傳代液體培養(yǎng)，酵母菌細(xì)胞數(shù)達(dá)到6 lgCFU/mL，植物乳桿菌細(xì)胞數(shù)達(dá)到8 lgCFU/mL，再將菌液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取菌泥用等體積蒸餾水重懸清洗3次，備用。

1.3.2 沙棘酵素的制備工藝

沙棘→清洗→瀝干水分→輻照→破碎→裝罐→加水→調(diào)節(jié)糖度、pH→接種發(fā)酵→過濾→成品

操作要點[20，29]：挑選新鮮沙棘果用純凈水沖洗干凈后瀝干水分，沙棘果、冰糖粉以及破碎、稱量等相關(guān)器具均在紫外燈下輻照處理30 min。利用小型水果破碎機將沙棘果果皮破碎后，將其與純凈水按料液比500∶1（g∶L）加入3 L無菌酵素發(fā)酵罐中，加入15%的冰糖粉并攪拌均勻，采用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至5.0，將活化好的Sc、Ha和Lp以1.0∶1.5∶2.5的菌種比例按10%的接種量接種到沙棘果與糖的混合發(fā)酵液中，充分混勻，先于28 ℃條件下發(fā)酵3 d后，調(diào)整發(fā)酵溫度于37 ℃條件下發(fā)酵5 d，再于26 ℃下密封發(fā)酵后熟至180 d，每個樣品3個重復(fù)，-80 ℃保存待檢測。

1.3.3 沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

分別考察初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、菌種比例（Sc∶Ha∶Lp）（1.0∶0.5∶1.5、1.0∶1.0∶2.0、1.0∶1.5∶2.5、1.0∶2.0∶3.0、1.0∶2.5∶3.5）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%）對沙棘酵素pH、可溶性固形物、總酸、感官品質(zhì)、還原力和SOD活性等品質(zhì)指標(biāo)的影響。

1.3.4 沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Box-Behnken模型試驗設(shè)計原理[21]，以初始pH值（A）、菌種比例（B）、接種量（C）為自變量，以沙棘酵素產(chǎn)品的SOD活性（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，試驗重復(fù)3次，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for multi-strain fermentation process optimization of Hippophae rhamnoides Jiaosu

1.3.5 測定方法

pH、總酸和可溶性固形物含量的測定：參照AMANDA E等[22]的方法；感官評價（滿分10分）和乙醇含量的測定：參照張海燕等[23]的方法；還原力（OD700nm值）的測定參照ZOMPRA A A等[24]的方法；超氧化物歧化酶活性的測定：參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》[25]；總酚含量的測定：參照LI T等[26]的方法；總黃酮含量的測定：參照MULTARI S等[27]的方法；多糖和維生素C（vitamin C，VC）含量的測定：參照蔡麗琴[28]的方法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次。采用Design-Expert 8.0、Microsoft Excel 2010和IBM SPSS 26等數(shù)據(jù)分析軟件對所獲的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理、作圖及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 初始pH值對沙棘酵素品質(zhì)的影響

初始pH值對沙棘酵素pH值、可溶性固形物含量、總酸含量、感官評分、還原力、SOD活性的影響見圖1。

圖1 初始pH值對沙棘酵素品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of initial pH value on Hippophae rhamnoides Jiaosu quality

不同的微生物適宜生長和耐受的pH是不同的，食用酵素發(fā)酵過程中，初始pH在很大程度上影響著微生物的生長和代謝產(chǎn)物的生成[29]。由圖1A可知，沙棘酵素的pH值和可溶性固形物含量均隨著初始pH的升高呈先降低后升高的趨勢，當(dāng)初始pH值為5.0時均最低，分別為2.98和3.50°Bx；然而總酸含量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)初始pH值為5.0時達(dá)到最大值為71.80 mg/mL。由圖1B可知，隨著初始pH值的升高，沙棘酵素的感官評分、還原力和SOD活性均呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)初始pH值為5.0時達(dá)到峰值，分別為8.05分、2.38和1 968.91 U/mL。說明初始pH值5.0保證了沙棘酵素發(fā)酵過程中微生物快速繁殖和生長代謝，有利于提高沙棘酵素的發(fā)酵效率，促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程的順利進(jìn)行，提高產(chǎn)品品質(zhì)。因此，選擇初始pH 4.5～5.5為最佳范圍進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.2 菌種比例對沙棘酵素品質(zhì)的影響

釀酒酵母、異常漢遜酵母與植物乳植物桿菌的菌種比例對沙棘酵素pH值、可溶性固形物含量、總酸含量、感官評分、還原力、SOD活性的影響見圖2。

圖2 菌種比例對沙棘酵素品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of strains ratio on Hippophae rhamnoides Jiaosu quality

乳酸菌與酵母菌之間存在著代謝產(chǎn)物互補機制，在促進(jìn)微生物共生、提高小分子活性物質(zhì)含量和改進(jìn)風(fēng)味品質(zhì)等方面起著重要的作用，多菌種發(fā)酵可以形成互利共生關(guān)系，有利于酵素的發(fā)酵過程[30]。由圖2可知，不同的菌種比例對沙棘酵素的pH、可溶性固形物含量、總酸含量、感官評分、還原力和SOD活性的影響較大，隨著菌種比例的變化，沙棘酵素的pH及可溶性固形物的含量均呈先降低后升高的趨勢，而總酸含量、感官評分、還原力和SOD活性均呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)Sc∶Ha∶Lp為1.0∶1.5∶2.5時，沙棘酵素的發(fā)酵進(jìn)程順利，發(fā)酵液pH和可溶性固形物含量最低，分別為3.01和3.61°Bx，總酸含量、感官評分、還原力和SOD活性最高，分別達(dá)到73.28 mg/mL、8.19分、2.40和1 970.33 U/mL，說明適宜比例的多菌種發(fā)酵，可提高沙棘酵素的品質(zhì)，這可能是因為酵母菌通過利用糖代謝作用降低了pH值和可溶性固形物含量，同時通過促進(jìn)乳酸菌的生長代謝增加了有機酸含量，而且乳酸菌與酵母菌協(xié)同發(fā)酵可能提高了對感官評價起到較好作用的風(fēng)味物質(zhì)含量和產(chǎn)品的抗氧化活性等[31]。因此，選擇Sc∶Ha∶Lp 1∶1.0∶2.0～1∶2.0∶3.0為適宜的菌種比例范圍進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.3 接種量對沙棘酵素品質(zhì)的影響

接種量對沙棘酵素pH值、可溶性固形物含量、總酸含量、感官評分、還原力、SOD活性的影響見圖3。

圖3 接種量對沙棘酵素品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of inoculum on Hippophae rhamnoides Jiaosu quality

接種量的大小直接影響著微生物生長繁殖的速度，較大的接種量可以縮短微生物生長代謝達(dá)到高峰的時間，提前形成目標(biāo)產(chǎn)物，并抑制雜菌的生長繁殖；但接種量過大或過小，均會影響發(fā)酵進(jìn)程，接種量過大，發(fā)酵初期代謝迅速，引起發(fā)酵液中溶氧不足，菌絲體提前衰老，乙醇含量超標(biāo)，影響微生物代謝產(chǎn)物合成；接種量過小，微生物生長代謝緩慢，培養(yǎng)時間延長，代謝產(chǎn)物合成緩慢或降低，從而降低了產(chǎn)品的質(zhì)量[32]。由圖3可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液pH和可溶性固形物含量均呈先降低后升高的趨勢，總酸含量、感官評分、還原力和SOD活性均呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)接種量為10%時，沙棘酵素發(fā)酵狀態(tài)最好，pH和可溶性固形物含量最低，分別為3.09和3.70°Bx，總酸含量、感官評分、還原力和SOD活性最高，分別為73.65 mg/mL、8.20分、2.41和1 972.33 U/mL。因此，選擇8%～12%為適宜的多菌種接種量范圍進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

食用植物酵素因其富含SOD活性而具有較好的保健功效，SOD活性的高低是其品質(zhì)的重要評價因子[14]。因此，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇初始pH值（A）、菌種比例（Sc∶Ha∶Lp）（B）、接種量（C）為影響因素，以SOD活性（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for multi-strain fermentation process optimization of Hippophae rhamnoides Jiaosu

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

利用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到SOD活性（Y）對自變量初始pH值（A）、菌種比例（Sc∶Ha∶Lp）（B）、接種量（C）的二次多項回歸模型方程為：Y=2239.08+182.40A-161.43B-65.07C+171.60AB+28.57AC+233.36BC-190.58A2-379.55B2-223.94C2。進(jìn)一步對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項P值為0.550 9＞0.05，不顯著，說明該方程合理可行；決定系數(shù)R2=0.998 3，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.996 2，說明該模型能夠解釋99.62%響應(yīng)值的變化，擬合程度較好，可用該回歸方程預(yù)測沙棘酵素多菌種發(fā)酵工藝條件。變異系數(shù)（variable co efficient，CV）=1.15%＜10%，表明試驗?zāi)Ｐ偷目尚哦群途_度高。由表3亦可知，一次項A、B、C均對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、BC和二次項A2、B2、C2對沙棘酵素SOD活性的影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對沙棘酵素SOD活性的影響顯著（P＜0.05），且各因素對沙棘酵素SOD活性影響的大小順序為：初始pH值（A）＞菌種比例（B）＞接種量（C）。

2.2.3 響應(yīng)面和等高線圖分析

響應(yīng)面和等高線圖可以直觀地反映各因素間交互作用對響應(yīng)值的影響程度，響應(yīng)曲面坡度越陡峭，等高線越密集，表明該因素對響應(yīng)值的影響越顯著，等高線越接近橢圓，兩個因素間的交互作用越強；反之則各因素間交互作用對響應(yīng)值的影響較小[33]。各因素間交互作用對沙棘酵素SOD活性影響的響應(yīng)面和等高線圖見圖4。

圖4 各因素間交互作用對沙棘酵素SOD活性影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between different factors on SOD activity

由圖4可知，AB和BC的響應(yīng)曲面陡峭，等高線密集且呈橢圓，說明初始pH值和菌種比例、菌種比例和接種量間交互作用對沙棘酵素SOD活性的影響較大，AC的響應(yīng)曲面較為陡峭，等高線較密集且接近橢圓，但相比AB和BC，交互作用影響較小，這與方差分析的結(jié)果一致。

2.2.4 最佳條件預(yù)測及驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行最大值分析，得到沙棘酵素多菌種發(fā)酵的最佳工藝條件為：初始pH值5.18，菌種（釀酒酵母∶異常漢遜酵母∶植物乳植物桿菌）比例1.0∶1.6∶2.6，接種量10.25%，在此條件下，沙棘酵素SOD活性的理論值為2 158.46 U/mL，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗證試驗，得到沙棘酵素的SOD活性實際值為（2 206.67±13.67）U/mL，與預(yù)測值的相對誤差為2.18%，與理論值誤差較小，說明該模型準(zhǔn)確可靠。

2.3 沙棘酵素產(chǎn)品品質(zhì)分析

沙棘酵素發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌等微生物利用糖原和原料中的蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分進(jìn)行新陳代謝，產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)，使其具有比原料更高、更好吸收的營養(yǎng)價值，而微生物的代謝過程不僅受微生物種類及自身代謝條件的影響，還因受到發(fā)酵液中pH、酸度、糖度及酒精度等物理、化學(xué)環(huán)境的影響，所得到的活性物質(zhì)的質(zhì)量及數(shù)量不同[34]。在最優(yōu)工藝條件下，沙棘酵素產(chǎn)品的pH為2.23，總酸含量為78.60 mg/mL，可溶性固形物含量為2.68°Bx，乙醇含量為0.05g/100mL，總酚含量為18.85mg/mL，總黃酮含量為12.49 mg/mL，VC含量為6.48 mg/mL，多糖含量為22.49 mg/mL，SOD活性為2 206.67 U/mL，還原力（OD700nm值）為2.65，產(chǎn)品色澤透亮金黃，香氣濃郁，感官評分為9.1分，產(chǎn)品理化指標(biāo)及感官指標(biāo)均符合輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5323—2018《植物酵素》的要求[35]。

3 結(jié)論

本研究以沙棘為原料，經(jīng)釀酒酵母、異常漢遜酵母、植物乳植物桿菌等多菌種發(fā)酵制備沙棘酵素，考察初始pH、菌種比例、接種量對沙棘酵素品質(zhì)的影響，進(jìn)一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化出沙棘酵素多菌種發(fā)酵最佳工藝條件為：初始pH 5.18、釀酒酵母、異常漢遜酵母與植物乳植物桿菌的菌種比例1∶1.6∶2.6、接種量10.25%。在此條件下，沙棘酵素產(chǎn)品色澤透亮金黃，香氣濃郁，感官評分為9.1分，其pH為2.23，總酸含量為78.60mg/mL，可溶性固形物含量為2.68°Bx，乙醇含量為0.05 g/100 mL，總酚含量為18.85 mg/mL，總黃酮含量為12.49 mg/mL，VC含量為6.48 mg/mL，多糖含量為22.49 mg/mL，SOD活性為2 206.67 U/mL，還原力（OD700nm值）為2.65，產(chǎn)品指標(biāo)符合輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5323—2018《植物酵素》的要求，為沙棘產(chǎn)業(yè)的綜合利用和酵素產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。