改良抗酸染色的新應(yīng)用在早期結(jié)核診斷中的價值分析

張培榮+徐加譽+廖子龍

【摘要】 目的 分析在薄層液基細(xì)胞制片上改良抗酸染色的陽性檢出率。方法 選取128例結(jié)核患者， 標(biāo)本種類為胸腹水、支氣管灌洗液、痰、心包積液及腦脊液， 薄層液基細(xì)胞制片后分別采用改良抗酸染色方法、傳統(tǒng)抗酸染色方法及實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)核檢測方法， 對細(xì)胞標(biāo)本三種檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 薄層液基細(xì)胞制片改良抗酸染色的陽性率為49.2%， 明顯高于傳統(tǒng)抗酸染色陽性率的33.6%， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.440， P<0.05）。薄層液基細(xì)胞制片實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)抗酸染色陽性率比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.667， P>0.05）。薄層液基細(xì)胞制片改良抗酸染色檢測陽性率高于實時熒光定量PCR， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.576， P>0.05）。結(jié)論 對于早期結(jié)合患者，薄層液基細(xì)胞制片改良抗酸染色的檢測陽性率明顯較高， 是一種早期診斷結(jié)核的可靠有效方法。

【關(guān)鍵詞】 改良抗酸染色；早期結(jié)核；診斷價值

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.22.017

在臨床工作中早期結(jié)核疾病診斷是臨床醫(yī)生棘手的問題之一， 隨著艾滋病、免疫抑制劑的應(yīng)用及結(jié)核耐藥菌株出現(xiàn)， 結(jié)核的發(fā)病率明顯上升， 與其他疾病相比早期結(jié)核的臨床癥狀日趨不典型性， 易引起臨床預(yù)估不準(zhǔn)， 導(dǎo)致初步診斷時遺漏病變或誤診腫瘤性疾病， 結(jié)核的早期診斷對臨床治愈具有十分重要意義， 抗酸染色操作簡單， 檢測時間短， 被公認(rèn)為診斷結(jié)核的有效使用方法， 但目前陽性率偏低， 困擾臨床推廣及應(yīng)用， 如何提高抗酸染色的陽性率一直是病理醫(yī)生研究的課題之一， 本項科研課題主要研究液基細(xì)胞標(biāo)本應(yīng)用改良抗酸染色方法確定結(jié)核診斷， 與傳統(tǒng)抗酸染色及PCR檢測結(jié)核的方法進(jìn)行比較， 進(jìn)行早期結(jié)核的診斷陽性率分析。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 選取本院2015年3月～2016年10月的128例結(jié)核患者為檢測對象， 其中男80例， 女48例， 年齡19～97歲， 平均年齡47歲， 標(biāo)本種類為胸腹水、支氣管灌洗液、痰、心包積液及腦脊液。

1. 2 方法 薄層液基細(xì)胞制片后分別采用改良抗酸染色方法、傳統(tǒng)抗酸染色方法及實時熒光定量PCR結(jié)核檢測方法。

1. 2. 1 實時熒光定量PCR檢測方法 應(yīng)用Eppdorf熒光定量PCR儀， 取單管單人份PCR反應(yīng)管3份， 直接加入處理后樣品、陰性質(zhì)控品及陽性質(zhì)控品2 ?l， 8000 rpm離心數(shù)秒， 放入PCR儀擴增， 擴增條件：93℃2 min預(yù)變性， 93℃45 s～55℃120 s， 反應(yīng)10個循環(huán)后置33℃保溫， 迅速逐個將反應(yīng)管放入熒光檢測儀， 最后93℃45 s～55℃120 s， 共做30個循環(huán)后置33℃保溫。

1. 2. 2 改良抗酸染色及傳統(tǒng)抗酸染色方法 操作步驟：新柏氏2000薄層液基細(xì)胞制片， 滴入苯酚堿性品紅液， 微波爐中低火8 min（傳統(tǒng)方法：滴入苯酚堿性品紅液室溫30 min）， 20%硫酸水溶液分化1～5 min， Mayer蘇木素復(fù)染。

1. 3 陽性檢測標(biāo)準(zhǔn)

1. 3. 1 結(jié)核PCR陽性標(biāo)準(zhǔn) 在實驗有效的前提下， 結(jié)核PCR檢測陽性AxP1-N）， 如果P1-N）>AxP1-N）則屬于實驗灰度區(qū)， 需重復(fù)實驗1次， 若重復(fù)結(jié)果AxP1-N）應(yīng)用判為陽性， 否則為陰性。

1. 3. 2 抗酸染色陽性標(biāo)準(zhǔn) 采用萋尼氏染色法（Z-N）鏡檢結(jié)果分級報告標(biāo)準(zhǔn)， 抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察300個不同視野， 未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌?？顾釛U菌陽性， 報告抗酸桿菌菌數(shù)：1～8條抗酸桿菌/300視野或抗酸桿菌陽性（1+）， （2+）， （3+）， （4+）均視為陽性。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 薄層液基細(xì)胞制片改良抗酸染色及傳統(tǒng)抗酸染色方法檢測結(jié)果比較 薄層液基細(xì)胞制片改良抗酸染色的陽性率為49.2%， 明顯高于傳統(tǒng)抗酸染色陽性率的33.6%， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.440， P<0.05）。見表1。

2. 2 薄層液基細(xì)胞制片實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)抗酸染色檢測結(jié)果比較 薄層液基細(xì)胞制片實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)抗酸染色陽性率比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.667， P>0.05）。見表2。

2. 3 薄層液基細(xì)胞制片改良抗酸染色與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果比較 薄層液基細(xì)胞制片改良抗酸染色檢測陽性率高于實時熒光定量PCR， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.576， P>0.05）。表3。

3 討論

世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病最新報告指出， 2013年全球約有900萬例活動性結(jié)核病患者， 150萬例病死。中國結(jié)核病發(fā)病率僅次于印度及俄羅斯， 特別是耐藥結(jié)核的出現(xiàn)， 嚴(yán)重影響人們的健康及經(jīng)濟發(fā)展[1， 2]。用于結(jié)核診斷的方法中細(xì)菌學(xué)檢測需要時間長， 生物安全級別要求較高， 血清學(xué)試驗檢測結(jié)核抗原或抗體不太理想。實時熒光定量PCR結(jié)核探針檢測結(jié)核桿菌的存在， 特異性比較高， 但敏感性不理想， 主要是目前結(jié)核分枝桿菌的基因變異性較大， 檢測時間較長， 目前臨床醫(yī)生仍以抗酸染色為結(jié)核檢測。 臨床上和流行病學(xué)中常用查見抗酸桿菌作為結(jié)核病診斷的依據(jù)[3]， 隨著臨床醫(yī)療水平的提升， 典型結(jié)核疾病易于臨床診斷， 能得到及時有效治療， 但目前結(jié)核臨床癥狀呈現(xiàn)不典型性， 導(dǎo)致錯過最佳治療階段， 早期結(jié)核疾病的診斷尤為重要。無創(chuàng)及微創(chuàng)下痰、 尿、 穿刺組織液、 胸腹水等液基細(xì)胞為早期結(jié)核診斷提供理想標(biāo)本， 此方法操作簡單， 經(jīng)濟快速制片， 分枝桿菌富集效果好， 提高抗酸染色陽性率是本次科研課題的主要研究目的。

本次實驗采集臨床確診結(jié)核患者的痰檢、 支氣管刷檢， 肺泡灌洗液、 胸腹水、 心包積液等標(biāo)本， 128例液基細(xì)胞制片后分別進(jìn)行傳統(tǒng)抗酸染色及改良抗酸染色方法， 同一病例實時熒光定量PCR應(yīng)用結(jié)核探針進(jìn)行檢測， 對三種實驗方法的結(jié)果進(jìn)行比較分析， 三種方法（改良抗酸染色、傳統(tǒng)抗酸染色及實時熒光定量PCR檢測）陽性率分別為49.2%， 33.6%， 41.4%， 前兩種檢測陽性率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 改良抗酸染色與實時熒光定量PCR檢出陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）， 改良抗酸染色陽性率稍高于實時熒光定量PCR陽性率， 操作簡單經(jīng)濟， 仍然視為結(jié)核檢測首選方法。實時熒光定量PCR檢測結(jié)核的特異性非常高， 實時熒光定量PCR技術(shù)可以檢出組織中結(jié)核分枝桿菌[4]， 但不能同時檢測出非結(jié)核分枝桿菌， 本實驗結(jié)果比王旭洲等[5]熒光定量 PCR檢測陽性率（51.50%）低。Agarwal等[6]報道如果標(biāo)本處理不當(dāng)或檢測程序不規(guī)范， 有可能會造成假陰性或者假陽性， 本次實驗結(jié)核探針PCR檢測的陽性率可能與此類因素有關(guān)。傳統(tǒng)抗酸染色的陽性率明顯低于改良抗酸染色， 本研究結(jié)果明顯高于楊銘等[7]報道的 16.33%， 本次實驗的傳統(tǒng)抗酸染色與改良抗酸染色陽性率均有增高， 可能與標(biāo)本制片程序較少、 細(xì)菌富集有關(guān)。

病理組織切片經(jīng)過固定、脫水、浸蠟等程序易對結(jié)核桿菌造成破壞， 而液基細(xì)胞制片相對操作程序較少， 抗酸染色陽性結(jié)核分枝桿菌形態(tài)明顯易見。此種方法把液基細(xì)胞技術(shù)與改良抗酸染色有機結(jié)合， 一方面在無創(chuàng)及微創(chuàng)下易于采集到早期診斷結(jié)核疾病的理想標(biāo)本， 易于被患者接受；另一方面此種實驗方法明顯提高早期結(jié)核診斷陽性率， 檢測時間短， 成本較低， 操作簡單， 最適合基層醫(yī)院推廣的早期結(jié)核檢測最佳方法。

目前抗酸染色陽性被認(rèn)為是診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)， 查找文獻(xiàn)有研究報道目前存在非結(jié)核分枝桿菌在抗酸染色陽性時鏡下形態(tài)十分相似， 因此， 在抗酸染色陽性的病例必須結(jié)合臨床特征及相應(yīng)檢查結(jié)果明確診斷。

綜上所述， 在液基細(xì)胞制片下改良抗酸染色是目前檢測早期結(jié)核的易于患者接受、 有效的檢測方法， 能明顯提高早期結(jié)核檢出率， 實現(xiàn)臨床對結(jié)核疾病的早診早治， 提高臨床治愈率。

參考文獻(xiàn)

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[6] Agarwal A. Comparative Evaluation of BacT/ALERT 3D Culture Medium and Nested PCR in the Diagnosis of Tuberculous Meningitis. Saarc Tuberculosis & Hiv/aids Centre， 2015（11）：15-20.

[7] 楊銘， 岳冀， 李曦， 等. 纖維支氣管鏡在支氣管結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值分析. 四川醫(yī)學(xué)， 2012， 33（8）：1394-1395.

[收稿日期：2017-03-30]