HPLC法測定脂溶性維生素注射液中維生素D2及維生素E的含量

陳光

[摘要] 目的 建立測定脂溶性維生素注射液中維生素D2、維生素E的高效液相色譜（HPIC）分析方法。 方法 應(yīng)用高效液相色譜法。維生素D2采用Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）色譜柱：以正已烷：異丙醇（97.5：2.5）為流動相：流速為1ml/min）：檢測波長為265nm：柱溫室溫：紫外測器。維生素E采用Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）色譜柱：以正已烷-異丙醇（99.5∶0.5）為流動相：流速為1mL/min：檢測波長為298nm：柱溫室溫：紫外檢測器。結(jié)果 維生素D2和維生素E分別在0.26～2.08?g/mL和0.64～3.20mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。維生素D2和維生素E的平均回收率分別為98.90%、100.2%、RSD分別為1.2%、1.1%。結(jié)論 本方法準確、快速、重現(xiàn)性好。

[關(guān)鍵詞] 維生素D2；維生素E；高效液相色譜法；含量測定

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-46-05

[Abstract ] Objective To develop the HPLC method for determination of vitamin D2，vitamin E content in the Fat-soluble vitamin injection. Methods High performance liquid chromatography（HPLC） was used.Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm） chromatographic column was used to determine vitamin D2，n-hexane： isopropanol（97.5：2.5） was as mobile phase，the flow rate was 1ml/min，wavelength was 265nm，under the condition of room temperature，and UV-detector were used.Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm） chromatographic column was used to determine vitamin E：n-hexane：isopropanol（99.5∶0.5） was as mobile phase，the flow rate was 1ml/min，the wavelength was 298nm，under the condition of room temperature，and UV-detector were used. Results There was a good linear relationship between the 0.26-2.08?g/mL range and peak area for vitamin D2，while the 0.64-320?g/mL range for vitamin E.The average recovery rate of vitamin D2 and vitamin E were 98.90% and 100.2%.RSD of vitamin D2 and vitamin E were 1.2% and 1.1%. Conclusion The method is accurate，rapid and reproducible.

[Key words] Vitamin D2；Vitamin E；Chromatography（HPLC）；Determination

脂溶性維生素注射液為含有維生素A、維生素D2、維生素E、維生素K1和注射用大豆油，卵磷脂等的滅菌乳劑，屬維生素類藥。用于脂溶性維生素缺乏的預(yù)防和治療。其中維生素D又稱鈣化醇，維生素D種類很多。以維生素D2（麥角鈣化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）較為重要。維生素D的主要生理功能是：調(diào)節(jié)鈣、磷代謝、促進鈣、磷吸收。缺乏時，兒童和哺乳期婦女更為明顯。維生素E[1-3]又名生育粉，維生素E有很強的抗氧化作用。同時具有提高維生素A功能的作用；維生素E缺乏將導(dǎo)致紅血球被破壞。肌肉的變性。貧血癥，生殖機能障礙等病變[4-6]，由于維生素E結(jié)構(gòu)復(fù)雜，異構(gòu)體多，準確分析測定較困難，近年來許多科學(xué)家致力于其分析的研究，開發(fā)了很多實用高效的檢測方法，既有物理和化學(xué)方法，也有儀器分析方法 ，既有維生素E的總含量檢測，也有異構(gòu)體含量檢測等。隨著多種復(fù)合維生素藥物的廣泛應(yīng)用，建立對這些維生素及其它成分的簡單、快速、準確的分析方法是非常必要的，高效液相色譜（HPLC）法是目前使用最普遍的測定維生素類的方法，應(yīng)用廣泛。維生素是維護人體健康、促進生長發(fā)育和調(diào)節(jié)生理機能所必需的一類有機化合物，通常按溶解性把維生素分為脂溶性和水溶性兩大類。

在參閱國內(nèi)有關(guān)報道[8-15]的基礎(chǔ)上，我們用高效液相色譜法測定了溶脂性維生素注射液中的維生素D2和維生素E含量。

1 儀器與試藥

KQ-250E 型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）：FA1100型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）：日立U-3010型紫外可見分光光度計：高效液相色譜儀，工作站及紫外檢測器（美國Agilent公司）；RE52-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海滬西分析儀器廠）。正已烷（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；已丙醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）：無水乙醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）：水為超純水。脂溶性維生素注射液，自制（批號20130224，20130410，20130415，20130420）；維生素D2對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號10155-0004）：維生素E 對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號10062-0007）。

2 實驗方法[7]

2.1 維生素D2方法學(xué)考察

2.1.1 維生素D2對照品溶液的制備 精密稱取維生素D2對照品5.20mg，用正已烷溶解并定溶至10mL，再移取1.0mL定溶至100mL，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取脂溶性維生素注射液10.0mL，加30mL無水乙醇搖勻，再用正已烷萃取三次，每次40mL，合并正已烷層，35℃減壓發(fā)揮至油狀殘渣，用正已烷溶解定溶至5mL，即得。

2.1.3 維生素D2檢測波長的確定 取對照品溶液適量，在200～600nm進行紫外掃描，結(jié)果在265nm有量大吸收，因此確定檢測波長為265 nm。

2.1.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱：Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）：流動相：正已烷：異丙醇（97.5：2.5）；體積流量：1.0mL/min：檢測波長：265nm：柱溫：室溫：檢測器：紫外檢測器。

2.1.5 專屬性實驗 取陰性溶液，供試品溶液及對照品溶液20?L進樣，結(jié)果在供試品色譜中，在與對照品主峰相應(yīng)位置處有明顯色譜峰，而陰性溶液色譜中則無此峰，表明此方法的專屬性良好。

2.2 維生素E方法學(xué)考察

2.2.1 維生素E對照品溶液的制備 精密稱取維生素E對照品4.00mg用正已烷溶解并定容至50mL，制得濃度為0.08mg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取脂溶性維生素注射液10.0mL，加無水乙醇約15mL搖勻，正已烷萃取三次，每次20mL，合并正已烷層，35℃ 減壓揮發(fā)至油狀殘渣，用正已烷溶解并定至5mL，再從中精密量取1mL定溶至100mL，即得。

2.2.3 維生素E檢測波長的確定 取對照品溶液適量，在200～600nm進行波長掃描，結(jié)果在298nm有最大吸收，因此求確定檢測波長為298 nm。

2.2.4 維生素E色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱：Kromasil 100-5sil（250mm×4.6mm）：流動相：正已烷-異丙醇（99.5：0.5）：體積流量：1.0mL/min：檢測波長：298nm：柱溫：室溫：檢測器：紫外檢測器：在此條件下，維生素E的理論塔板數(shù)為17732，鄰雜質(zhì)峰的分離度為：3.31，且峰形較好，系統(tǒng)適用性考察結(jié)果符合藥典要求。

2.2.5 專屬性試驗 取陰性溶液，供試品溶液及對照溶液各10?L進樣。結(jié)果在供試品色譜中，在與對照品主峰相應(yīng)位置處有明顯色譜峰，而陰性溶液色譜中則無此峰，表明此方法的專屬性良好。

3 結(jié)果

3.1 維生素 D2試驗結(jié)果

3.1.1 線性關(guān)系考察 參照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VID）實驗。精密吸取對照品溶液0.5、1、2、3、4mL，加甲醇稀釋至10mL，混勻。分別吸取不同濃度的對照品溶液依次注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以維生素D2濃度與峰面積進行線性回歸。得維生素D2回歸方程Y=38.423Х-0.85，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明：維生素D2在0.26～2.08?g/mL范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系。

3.1.2 穩(wěn)定性考察 精密吸取線性關(guān)系考察中的對照品溶液 （濃度為1.04 ?g/mL）20?L分別于0h、1h、2h、4h、8h進樣。記錄維生素D2峰面積，結(jié)果表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足測定要求。

3.1.3 重復(fù)性考察 精密吸取線性關(guān)系考察中對照品溶液（濃度為1.56?g/mL），柱入液相色譜儀，記錄維生素D2峰面積，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

3.1.4 中間精密度考察 對同一批制劑，在3天內(nèi)不同的時間，由不同操作者，不同儀器。采用不同的色譜條件（Alltima Silica 250mm×4.6mm：Kromasil 100-5sil 250mm×4.6mm）及樣品處理方法測定維生素D2的濃度，結(jié)果表明本方法的中間精密度良好。

3.1.5 重現(xiàn)性考察 平行取脂溶性維生素注射液5份，按供試品制備方法處理，并測定維生素D2含量，結(jié)果RSD=1.2%，表明本方法的重現(xiàn)性良好。

3.1.6 加樣回收實驗[4] 稱取已知含量的脂溶性維生素注射液（批號：20130224 維生素D2 0.52?g/mL）加入維生素 D2適量。如法測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1～6。方法學(xué)考察結(jié)論：維生素D2在0.26～2.08 ?g/mL范圍內(nèi)，線性相關(guān)性。精密度。準確度均良好。而且樣品的穩(wěn)定性、方法的重現(xiàn)性均能滿足測定要求。

3.1.7 維生素D2含量測定 取三批產(chǎn)品（批號：20130410，20130415，20130420）各三個樣品。按供試品制備方法制備，精密量取20 ?L， 注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算樣品濃度，三批樣品濃度均在標示量的 90%～110%之間，含量穩(wěn)定，表明制劑工藝已基本穩(wěn)定。

3.2 VE試驗結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系考察 參照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VID試驗，精密量取維生素E對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置于10mL容量瓶中，用正已烷定容至刻度。分別吸取不同濃度的對照品溶液依次柱入高效液相色譜儀，測定峰面積，以維生素E濃度與峰面積進行線性回歸，得維生素E回歸方程Y=8.2938Х+1.45，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，結(jié)果表明：維生素E在0.46～3.20?g/mL范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系。

3.2.2 穩(wěn)定性考察 精密量取供試品10?L分別于0h、1h、2h、4h、8h末進樣，測定峰面積，結(jié)果表明：供試品在8h內(nèi)穩(wěn)定。能滿足測定要求。

3.2.3 重復(fù)性考察 精密吸取線性關(guān)系考察中濃度為24.0?g/mL的對照品，注入液相色譜儀，記錄維生素E的峰面積，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

3.2.4 中間精密度考察 對同一批制劑，在3天內(nèi)不同的時間，由不同操作者，不同儀器，采用不同的色譜條件（Alltima Silica 250×4.6mm，5um：Kromasil 100-5sil 250×4.6mm）及樣品處理方法測定維生素E的濃度，結(jié)果表明本方法的中間精密度良好。

3.2.5 重現(xiàn)性考察 按供試品制備方法對一批5個小試產(chǎn)品進行處理，然后各精密量取10?L，注入色譜儀，記錄峰面積，計算樣品濃度。

3.2.6 加入回收實驗[4] 稱取已知含量的脂溶性維生素注射液（批號：20130224，維生素E含量920.5?g/mL），加入維生素E適量，如法測定含量。計算回收率，結(jié)果見表2～6。由表13可知本測定方法的回收率高，符合含量測定的要求。方法學(xué)考察結(jié)論：維生素E在8.0～40.0?g/mL濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)性，精密度，準確度，均良好，而且樣品的穩(wěn)定性，方法的重現(xiàn)性均能滿足測定要求。

3.2.7 含量測定 取三批產(chǎn)品（20130410，20130415，20130420）各三個樣品，按供試品制備方法制備，精密量取20?L，注入液相色譜儀，記錄峰面積。計算樣品濃度。三批樣品濃度均在標示量的90%～110%之間。含量穩(wěn)定。表明制劑工藝已基本穩(wěn)定。

4 討論

本實驗采用 HPLC 法直接測定脂溶性維生素注射液中維生素D2，維生素E的含量。方法簡便、準確、快速?？勺鳛樵撝苿┲芯S生素D2，維生素E的含量控制方法。維生素D2和維生素E的吸收波長分別是265、298nm，試驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。維生素D2在0.26/～2.08?g/mL范圍內(nèi)，維生素E在8.0～40.0?g/mL濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)性，精密度，準確度，均良好，而且樣品的穩(wěn)定性，方法的重現(xiàn)性均能滿足測定要求。

本實驗對脂溶性維生素注射液的提取做了一些改進，以前采用提取異丙醇的方法，但異丙醇提取液放置一段時間后會分層，影響測定。雖然維生素D2，維生素E為脂溶性，但制劑中表現(xiàn)為水包油型，所以無法用正已烷萃取的方法進行提取。因此我們采用無水乙醇溶解，正已烷萃取的方法進行提取。由于分析純正已烷存在比較明顯的雜質(zhì)峰，對結(jié)果測定影響明顯。所以，在整個定容過程中應(yīng)使用色譜純正已烷定容，以保證樣品的重現(xiàn)性和色譜柱的分類效能。

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（收稿日期：2017-05-26）