• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    巴戟天多糖含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中Cbfa—1mRNA表達的影響

    2017-08-29 23:56:45賴滿香馮娟阮志燕
    中國醫(yī)藥科學(xué) 2017年15期
    關(guān)鍵詞:巴戟天含藥成骨

    賴滿香 馮娟 阮志燕

    [摘要] 目的 探討巴戟天多糖含藥血清對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)骨向分化過程中核心結(jié)合因子ɑ-1(Cbfɑ-1)mRNA表達的影響。 方法 全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,采用pNPP法檢測不同濃度r巴戟天多糖含藥血清(高、中、低)對BMSCs堿性磷酸酶(ALP)活性的影響,并以其最佳作用濃度進行后續(xù)實驗,后續(xù)實驗分成空白組、成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組、聯(lián)合組(巴戟天多糖含藥血清組+成骨誘導(dǎo)組),各組用藥14d,采用RT-PCR技術(shù)檢測各組BMSCs Cbfa-1 mRNA表達的情況。 結(jié)果 與對照組比較,不同劑量的巴戟天多糖含藥血清均可提高BMSCs分泌ALP(F=126.278,P<0.05),其中高劑量組的作用強度高于其它劑量組;與空白組相比,成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組、聯(lián)合組均能上調(diào)BMSCs中Cbfa-1 mRNA的表達(F=261.412,P<0.05);但與成骨誘導(dǎo)組相比,巴戟天多糖含藥血清組不及成骨誘導(dǎo)組,兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.721,P<0.05)。 結(jié)論 巴戟天多糖含藥血清能夠促進BMSCs向成骨細胞分化,并能上調(diào)Cbfa-1 mRNA的表達,但其作用不及成骨誘導(dǎo)強。

    [關(guān)鍵詞] 巴戟天多糖含藥血清;骨髓間充質(zhì)干細胞;堿性磷酸酶;骨向分化;Cbfa-1

    [中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616(2017)15-27-04

    [Abstract] Objective To investigate the effects of morindae officinalis polysaccharide (MOP) containing serum on Cbfa-1 mRNA expression during the differentiation from BMSCs to the osteoblast. Methods BMSCs were isolated by whole bone marrow adherent method.Different concentrations of MOP-containing serum,including high dosage,middle dosage and low dosage,were added to BMSCs section to detect the alkaline phosphatase (ALP) activity by pNPP method,the best dosage was added to the next experiment.BMSCs were divided into the blank group,the osteogenic induced group,the MOP-containing serum group,MOP-containing serum and the osteogenic induced co-culture group.Cbfa-1 mRNA in each group were detected by RT-PCR at day 14. Results Compared with the control group,different concentrations of MOP-containing serum could elevate serum ALP activities(F=126.278,P<0.05),and the high dosage was the best.Compared with the blank group,Cbfa-1 mRNA expression levels increased in the osteogenic induced group,MOP-containing serum group and co-culture group, difference has statistical significance(F=261.412, P<0.05).Cbfa-1 mRNA expression levels was lower than the osteogenic induced group, difference had statistical significance(t=26.721,P<0.05). Conclusion The MOP-containing serum can promote the differentiation of BMSCs to osteoblasts,and increase Cbfa-1 mRNA expression,but its strength is lower than the osteogenic induced.

    [Key words] MOP-containing serum;Bone marrow mesenchymal stem cell;Alkaline phosphatase;Osteogenic differentiation;Cbfa-1

    巴戟天為茜草科多年生藤植物,為我國著名的四大南之一,現(xiàn)代藥理研究證明:巴戟天具有強壯骨骼、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)甲狀腺功能、抗衰老、抗

    疲勞、增強記憶、抗腫瘤及促進造血等作用[1]。巴戟天多糖(morindae officinalis polysaccharide,MOP)為巴戟天的有效成分之一,有實驗研究證實,巴戟天多糖具有預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[2-3],體外能促進成骨細胞增殖,提高成骨細胞分泌ALP與骨鈣素,抑制破骨細胞活性[4],巴戟天提取物能促進MSCs向成骨細胞分化,并能加強Cbfa1的表達[5],但巴戟天作用于MSCs的具體成分不清。本實驗觀察巴戟天多糖含藥血清對SD大鼠BMSCs向成骨分化過程中核心結(jié)合因子ɑ-1(Cbfɑ-1)表達的影響,從干細胞水平探討巴戟天多糖促BMSCs骨向分化中的可能作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    實驗所用動物為清潔級3月齡SD大鼠40只,體重245~255g;清潔級3月齡SD雌性大鼠1只,體重250g,用于BMSCs的提取。所用大鼠均由暨南大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號:SYXK(粵)第2012-0117)。

    1.2 儀器、藥物與試劑

    3111系列CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo Forma公司,SWCJ-1超凈工作臺購于蘇州凈化設(shè)備有限公司,BPH-300倒置相差顯微鏡購于日本Nikon公司。9600 PCR擴增儀購于美國PE公司。

    巴戟天多糖購于陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司;ALP測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所,Trizol Reagent購于北京賽百盛公司,RT試劑盒購于日本東洋坊。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 巴戟天多糖含藥血清制備 按照隨機數(shù)字法將40只大鼠分成4組,每組10只。高劑量組每天給予巴戟天多糖2.5g/kg;中劑量組每天給予巴戟天多糖1g/kg;低劑量組每天給予巴戟天多糖0.5g/kg;對照組不給予藥物,每天灌胃生理鹽水100mL/kg;每組連續(xù)給藥7d。

    1.3.2 BMSCs細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 采用全骨髓貼壁法,取3月齡SD大鼠拉頸處死,于75%乙醇消毒,取出大鼠股骨,切除股骨兩端骨骺,用PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔,收集混合液,1500r/min,離心5min,吸走上清液,用含10% FBS的低糖DMEM 培養(yǎng)液重懸細胞,并以5×106/mL的密度將細胞接種到25cm2塑料培養(yǎng)瓶中,置于37℃、體積為5%飽和濕度的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下,觀察BMSCs在生長過程中的形態(tài)變化。取生長良好的第3代細胞,采用流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD29,CD44,CD45,CD34的表達,以確定是否符合BMSCs的生物特征。

    1.3.3 pNPP法檢測巴戟天多糖含藥血清對BMSCs ALP的影響 取生長良好的第三代BMSCs,分別加入巴戟天多糖含藥血清高、中、低劑量組培養(yǎng)液和對照組培養(yǎng)液,連續(xù)干預(yù)14d。收集各組細胞上清液,采用pNPP法進行ALP含量的測定。并從中選取巴戟天多糖含藥血清促BMSCs分泌ALP的最佳劑量應(yīng)用于后續(xù)實驗。

    1.3.4 RT-PCR檢測各組BMSCs Cbfa-1 mRNA的表達 取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs,分別添加空白組(含15%胎牛血清低糖DMEM完全培養(yǎng)液),成骨誘導(dǎo)組(低糖DMEM 培養(yǎng)液+15%胎牛血清+10-8 mol/L地塞米松+50 mg/L維生素C+10-2mol/Lβ磷酸甘油),巴戟天多糖含藥血清組(低糖DMEM培養(yǎng)液+MOP含藥血清促BMSCs分泌ALP的最佳劑量)和聯(lián)合組培養(yǎng)液(MOP含藥血清組+成骨誘導(dǎo)組),培養(yǎng)14d后采用RT-PCR檢測Cbfa-1 mRNA的表達。以β-actin進行標準化,行半定量分析。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    本研究采用Stata11.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以()表示,兩兩比較采用t檢驗,多組間比較運用單因素方差分析,計數(shù)資料以百分比表示,采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 BMSCs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

    剛接種的細胞懸浮于培養(yǎng)液中,呈圓形,后48h后逐漸出現(xiàn)貼壁細胞,形態(tài)由圓盤狀逐漸向外伸出突起而轉(zhuǎn)變短梭形(圖1)。72h附壁鋪伸細胞數(shù)量增多,呈多細胞集落性分布,彼此不相接觸。第4、5天開始形成典型的呈均勻分布的MSCs簇狀增生灶,且隨培養(yǎng)時間的延長,成纖維細胞樣集落形成量逐漸增多,細胞形態(tài)發(fā)生了根本的變化,呈長梭形,緊密排列。第6天后MSCs迅速增殖擴增,不僅成纖維細胞樣集落形成數(shù)量迅速增加,而且還不斷擴大,相互間融合。隨著細胞數(shù)量增加體積增大,細胞形態(tài)趨于一致。10~14d,非附壁細胞經(jīng)反復(fù)換液而消失,細胞90%以上融合,融合細胞都呈梭形,緊密排列類似漩渦狀(圖2)。第3代細胞經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:CD44、CD29陽性細胞比率分別為97.56%和95.24%,CD45、CD34陽性細胞比率分別為0.57%和0.48%。符合BMSCs的生物學(xué)特性。

    2.2 巴戟天多糖含藥血清對BMSCs ALP的影響

    與對照組相比,巴戟天多糖含藥血清高、中、低劑量組的ALP 活性均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=126.278,P<0.05),各劑量組作用的強弱:巴戟天多糖含藥血清高劑量>巴戟天多糖含藥血清中劑量組>巴戟天多糖含藥血清低劑量組,結(jié)果表明,巴戟天多糖含藥血清具有促進BMSCs分泌ALP,其中高劑量組促BMSCs分泌ALP的能力最佳。見表1。

    2.3 各組Cbfa-1 mRNA的表達水平

    經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示:成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組和聯(lián)合組的輝度比值高于空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=261.412,P<0.05);成骨誘導(dǎo)組與巴戟天多糖含藥血清組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.721,P<0.05)。

    3 討論

    骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)起源于骨髓的中胚層,是一種具有多向分化潛能的非造血干細胞,在體外不同的誘導(dǎo)條件下,能分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肝實質(zhì)細胞等多種細胞[1]。因其具有取材方便,體外增殖能力強,長期傳代不改變生物學(xué)特征等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于骨組織工程中。本實驗采用最常用的全骨髓貼壁法[6]進行BMSCs細胞培養(yǎng)。實驗結(jié)果可見細胞接種后48h內(nèi)即可貼壁,72h后大部分細胞貼壁生長;細胞首次接種培養(yǎng)10d后即可達到80%以上融合,經(jīng)過幾次傳代后,生長的細胞呈形態(tài)均一、排列有序的成纖維樣細胞。細胞周期檢測中可見近90%以上的細胞處于G0/G1期,說明經(jīng)擴增至P3代的BMSCs 仍有一部分細胞處于相對靜止未分化的狀態(tài),從而可保證用于后續(xù)基因傳遞的細胞仍保持干細胞特性,符合BMSCs的生物學(xué)特性[7]。

    BMSCs向成骨細胞分化過程中的重要表現(xiàn)是細胞能夠合成、分泌表達成骨特異性的蛋白和細胞外基質(zhì)分。有研究證明,ALP是早期BMSCs向成骨細胞分化的關(guān)鍵性標志之一[8-9]。ALP是一種鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白,能促進細胞成熟和鈣化[10],ALP活性越高說明成骨細胞前體細胞向成熟成骨細胞分化越明顯。因此ALP在BMSCs骨向分化中扮演重要角色,測定ALP活性變化可以衡量BMSCs骨向分化的成熟程度[11]。本實驗選用ALP活性來評價不同劑量的MOP含血清對BMSCs分泌ALP的影響,并以此篩選最佳的促骨向分化濃度,以應(yīng)用到后續(xù)實驗。結(jié)果顯示,不同劑量的MOP含藥血清組可增加BMSCs上清液中的ALP的表達與分泌,這說明在此濃度范圍內(nèi)的MOP含藥血清能夠促進BMSCs向成骨細胞方向分化,其中高劑量MOP含藥血清效果最佳。

    核心結(jié)合因子a(core binding factor alpha 1,Cbfa1)是runt結(jié)構(gòu)域家族成員,其表達僅在骨組織和成骨細胞中檢測到[12]。有研究表明Cbfa1是MSCs向成骨細胞分化過程中的一種骨特異性轉(zhuǎn)錄因子,為骨形成的關(guān)鍵基因,是成骨細胞分化和功能的中心調(diào)控因子,決定著成骨細胞的發(fā)生與分化[13]。在敲除Cbfa1基因的小鼠模型實驗中發(fā)現(xiàn),缺少此基因可阻礙小鼠成骨細胞分化,抑制小鼠骨骼的軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨,而Cbfa1(+/-)雜合子小鼠表現(xiàn)育不全及顱骨鈣化延遲[14]。Ducy等[15]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠的胚胎發(fā)育期,可見Cbfal mRNA在顱骨、中軸骨及四肢骨MSCs聚集區(qū)表達,而這些細胞是均能分化成成骨細胞及成軟骨細胞的雙能前體細胞,此后,隨著胚胎的進一步發(fā)育,當MSCs進一步分化時,Cbfal只表達于向成骨細胞定向分化的細胞中,而在已分化了的軟骨細胞中已檢測不到它。由此可見,在BMSCs向成骨細胞分化中需要Cbfal的參與。本實驗檢測MOP含藥血清在誘導(dǎo)BMSCs骨向分化過程中Cbfa-1基因表達的變化。結(jié)果顯示,成骨誘導(dǎo)組、巴戟天多糖含藥血清組和聯(lián)合組的Cbfa-1 mRNA表達均有升高空白組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示MOP含藥血清在促BMSCs骨向分化過程中,可以上調(diào)Cbfa-1 mRNA的表達。而與成骨誘導(dǎo)組比較,巴戟天多糖含藥血清組不及成骨誘導(dǎo)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示MOP含藥血清的作用強度不及化學(xué)誘導(dǎo)劑。

    綜上所述,本研究證明巴戟天多糖含藥血清可以促進BMSCs向成骨分化,這一過程中,上調(diào)Cbfa1mRNA的表達可能是其作用機制之一。

    [參考文獻]

    [1] 陳彩英,詹若挺,陳蔚文.巴戟天的藥理研究進展[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(3):291-293.

    [2] 李楠,王和鳴,郭素華,等.巴戟天多糖含藥血清對體外培養(yǎng)成骨細胞凋亡的保護作用觀察[J].中國骨傷,2008,21(1):39-41.

    [3] 李楠,王和鳴,郭素華,等.巴戟天多糖對體外培養(yǎng)成骨細胞核心結(jié)合因子ɑ1m RNA表達的影響[J].中華中 醫(yī)藥雜志,2007,22(8):517-519.

    [4] 崔可賾,劉亦恒,張壽,等.巴戟天多糖含藥血清對體外成骨細胞DKK-1表達的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(4):871-872.

    [5] 王和鳴,王力,李楠.巴戟天對骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化過程Cbfa1表達的影響[J].中國中醫(yī)骨傷雜志,2004,12(6):22-26.

    [6] Qu F,Zhao Z,Yuan B,et al.Ca MKII plays a part in the chondrogen-esis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(5):5981-5987.

    [7] 宋珂,石琦,青瑩,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及鑒定的相關(guān)研究[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(9):531-535.

    [8] Morimichi Mizuno,Yoshinori.Osteoblast-related gene expression of bone marrow cell during the osteoblastic differentiation induced by typeⅠcollagen[J].Biochem,2001,129(1):133.

    [9] Sammons J,Ahmed N.The role of BMP-6,IL-6,and BMP-4In mesenchymal stem cell-dependent bone development:effects on osteoblastic differentiation induced by parathyroid hormone and vitam in D(3)[J].StemCells,2004,13(3):273.

    [10] 傅淑平,楊麗,洪浩,等.淫羊藿苷促SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化作用的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015,35(7):839-846.

    [11] Shamblott MJ,Axelman J,Wang S,et al.Derivation of pluripotent stem cell form cultured human primordial germcell[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,95( 23):13721-13726.

    [12] 董世武,應(yīng)大君,段小軍,等.核心結(jié)合因子α1對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨細胞標志基因表達的影響[J].中國修復(fù)重建外科學(xué)雜志,2005,19(9):746-750.

    [13] Lee JS,Thomas DM,Gutierrez G,et al.HES1 cooperates with pRb to activate RUNX2-dependent transcription[J].Bone miner RES,2006,21(6):921-933.

    [14] Otto F,Thornell AP,Crompton T,et al.Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome,is essential for osteoblast differentiation and boen development[J].Cell,1997,89(5):765-771.

    [15] Ducy P,Zhang R, Geoffroy V, et al. Osf2/Cbfal. a transcriptional activator of osteoblast diflerentiation[J].Cell, 1997,89(5):747-754.

    (收稿日期:2017-05-11)

    猜你喜歡
    巴戟天含藥成骨
    經(jīng)典Wnt信號通路與牙周膜干細胞成骨分化
    巴戟天化學(xué)成分的研究
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:38:34
    廣東省巴戟天DNA條形碼及遺傳多樣性分析
    急救含藥姿勢要正確
    巴戟天及其炮制品對腎陽虛大鼠HPA軸功能的改善作用
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:57:22
    乳病消片含藥血清對MCF-7細胞增殖的抑制作用
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:40:44
    糖尿病大鼠Nfic與成骨相關(guān)基因表達的研究
    液晶/聚氨酯復(fù)合基底影響rBMSCs成骨分化的研究
    30例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折術(shù)后康復(fù)護理
    天津護理(2015年4期)2015-11-10 06:11:41
    巴戟天薄層色譜鑒別用對照提取物的研制與應(yīng)用
    91午夜精品亚洲一区二区三区 | 中文字幕免费在线视频6| 欧美黑人巨大hd| 国产一区二区亚洲精品在线观看| www.999成人在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久久久大精品| 三级国产精品欧美在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 一级作爱视频免费观看| 嫩草影院新地址| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美精品啪啪一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲精品一区av在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲精品成人久久久久久| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 校园春色视频在线观看| 又爽又黄a免费视频| 欧美高清性xxxxhd video| 能在线免费观看的黄片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 在线观看午夜福利视频| 欧美日韩乱码在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 黄色一级大片看看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 高潮久久久久久久久久久不卡| xxxwww97欧美| а√天堂www在线а√下载| 看免费av毛片| 亚洲久久久久久中文字幕| 美女高潮的动态| 国产单亲对白刺激| 国产美女午夜福利| 97超视频在线观看视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品99久久久久久久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲自拍偷在线| 久久九九热精品免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 色尼玛亚洲综合影院| 18禁黄网站禁片免费观看直播| av在线观看视频网站免费| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久久久精品吃奶| 国模一区二区三区四区视频| 国产精华一区二区三区| 禁无遮挡网站| 中国美女看黄片| 青草久久国产| 成年人黄色毛片网站| 99热这里只有是精品在线观看 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费看美女性在线毛片视频| 午夜福利在线在线| 亚洲精品456在线播放app | 国产伦精品一区二区三区视频9| 在线观看免费视频日本深夜| 乱码一卡2卡4卡精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看免费视频日本深夜| 少妇丰满av| 一二三四社区在线视频社区8| 天美传媒精品一区二区| 99热这里只有是精品在线观看 | 变态另类丝袜制服| 色哟哟·www| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日韩高清综合在线| 一区二区三区高清视频在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲18禁久久av| 婷婷精品国产亚洲av在线| 免费在线观看影片大全网站| 激情在线观看视频在线高清| 午夜视频国产福利| 久久伊人香网站| 我的女老师完整版在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av二区三区四区| 久久久久久久久久成人| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产在线精品亚洲第一网站| 赤兔流量卡办理| 日本熟妇午夜| 亚洲色图av天堂| av在线蜜桃| 男人舔奶头视频| 亚洲av五月六月丁香网| 免费无遮挡裸体视频| 成人美女网站在线观看视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 桃色一区二区三区在线观看| 免费观看的影片在线观看| 毛片女人毛片| 男女之事视频高清在线观看| 久久中文看片网| 我要看日韩黄色一级片| 99精品久久久久人妻精品| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产探花极品一区二区| 午夜a级毛片| 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看亚洲国产| 精品国内亚洲2022精品成人| 中文字幕av在线有码专区| 国内精品一区二区在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 免费av毛片视频| 一a级毛片在线观看| 国产野战对白在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 88av欧美| 天美传媒精品一区二区| 丰满乱子伦码专区| 免费看光身美女| 伦理电影大哥的女人| 白带黄色成豆腐渣| 激情在线观看视频在线高清| 高清在线国产一区| 午夜日韩欧美国产| 怎么达到女性高潮| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 一本一本综合久久| 国产精品一及| 国产高潮美女av| 国内精品久久久久精免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日韩欧美精品v在线| 两个人的视频大全免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 成年女人永久免费观看视频| 国产91精品成人一区二区三区| 精品久久久久久,| 一个人看的www免费观看视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 免费人成在线观看视频色| 国产精品久久电影中文字幕| 午夜免费激情av| 听说在线观看完整版免费高清| 国内揄拍国产精品人妻在线| 美女大奶头视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产色婷婷99| 精品日产1卡2卡| 毛片女人毛片| 久久亚洲真实| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产成人福利小说| 免费电影在线观看免费观看| 国产在视频线在精品| 国产视频内射| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产高清激情床上av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产黄片美女视频| 国产伦在线观看视频一区| 天堂影院成人在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩av在线大香蕉| 两个人视频免费观看高清| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美一区二区国产精品久久精品| 90打野战视频偷拍视频| 97超视频在线观看视频| 国产成人福利小说| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 日本 av在线| 嫩草影视91久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩欧美 国产精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 婷婷六月久久综合丁香| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品国产自在天天线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 赤兔流量卡办理| 成年版毛片免费区| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜福利18| 3wmmmm亚洲av在线观看| 色哟哟·www| 天美传媒精品一区二区| 日韩有码中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩免费av在线播放| 日本与韩国留学比较| av欧美777| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 精品一区二区三区视频在线| 精品欧美国产一区二区三| 欧美日韩福利视频一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 欧美zozozo另类| 久久亚洲真实| 午夜福利视频1000在线观看| 99热6这里只有精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产视频内射| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 看黄色毛片网站| 天堂网av新在线| 欧美高清成人免费视频www| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久精品国产自在天天线| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品一区二区三区人妻视频| 午夜久久久久精精品| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 婷婷亚洲欧美| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 午夜精品久久久久久毛片777| 99热6这里只有精品| 内地一区二区视频在线| 欧美高清性xxxxhd video| 国产色爽女视频免费观看| 在线播放无遮挡| 女同久久另类99精品国产91| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美日本视频| 天堂网av新在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日本三级黄在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 男人舔奶头视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 999久久久精品免费观看国产| 国产午夜福利久久久久久| 精品国产亚洲在线| 欧美日韩综合久久久久久 | av国产免费在线观看| 深夜a级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久亚洲av毛片大全| 村上凉子中文字幕在线| 国产三级中文精品| 成人国产综合亚洲| 日本与韩国留学比较| 欧美性猛交黑人性爽| aaaaa片日本免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久国产成人精品二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产大屁股一区二区在线视频| 国产黄片美女视频| 久久99热这里只有精品18| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲国产精品成人综合色| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美潮喷喷水| 在线a可以看的网站| 亚洲激情在线av| 最近视频中文字幕2019在线8| 毛片女人毛片| 国产大屁股一区二区在线视频| 天天一区二区日本电影三级| 网址你懂的国产日韩在线| 俺也久久电影网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美+日韩+精品| 一区二区三区高清视频在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 69av精品久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 制服丝袜大香蕉在线| 中出人妻视频一区二区| 成人永久免费在线观看视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久午夜福利片| 国产欧美日韩一区二区精品| 桃色一区二区三区在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品一区二区免费欧美| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 不卡一级毛片| 热99在线观看视频| 欧美日韩乱码在线| 免费大片18禁| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产综合懂色| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲国产精品合色在线| 成人av一区二区三区在线看| 午夜福利欧美成人| av在线天堂中文字幕| 毛片女人毛片| 国产在视频线在精品| 国产免费男女视频| 国产高清视频在线播放一区| 在线免费观看的www视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美丝袜亚洲另类 | 日本 欧美在线| 久久久久性生活片| 国产精品永久免费网站| 国内精品一区二区在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 午夜福利欧美成人| 欧美一区二区国产精品久久精品| 麻豆国产av国片精品| 国产探花在线观看一区二区| 精品久久久久久,| 国产高清有码在线观看视频| 成年免费大片在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲 国产 在线| 黄片小视频在线播放| 免费观看人在逋| 久久久色成人| 直男gayav资源| 免费看光身美女| 此物有八面人人有两片| 色吧在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 色精品久久人妻99蜜桃| av黄色大香蕉| 免费无遮挡裸体视频| 午夜影院日韩av| 宅男免费午夜| 久久久精品欧美日韩精品| 99热6这里只有精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日本五十路高清| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产高清三级在线| 757午夜福利合集在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产高清有码在线观看视频| 欧美中文日本在线观看视频| 国产亚洲精品av在线| 亚洲中文字幕日韩| 搡老岳熟女国产| 国产av不卡久久| 69人妻影院| 99久久精品国产亚洲精品| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品野战在线观看| 中文资源天堂在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 好男人电影高清在线观看| 丁香欧美五月| 成人特级av手机在线观看| 日本一二三区视频观看| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美三级亚洲精品| 少妇的逼好多水| 最近视频中文字幕2019在线8| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日日夜夜操网爽| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产乱人视频| 香蕉av资源在线| 99国产综合亚洲精品| 成人av在线播放网站| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产精品国产高清国产av| 国产爱豆传媒在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久午夜福利片| 国产单亲对白刺激| 色av中文字幕| 搞女人的毛片| 国产三级在线视频| 国产一区二区在线av高清观看| 毛片女人毛片| 日韩欧美国产在线观看| av天堂中文字幕网| 他把我摸到了高潮在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 十八禁人妻一区二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产av一区在线观看免费| 搞女人的毛片| 最好的美女福利视频网| 亚洲av一区综合| 国产精华一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 香蕉av资源在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 夜夜爽天天搞| 两个人视频免费观看高清| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线a可以看的网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产大屁股一区二区在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 深夜精品福利| av女优亚洲男人天堂| 伊人久久精品亚洲午夜| 色哟哟·www| www.熟女人妻精品国产| 色在线成人网| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产熟女xx| 亚州av有码| 免费看日本二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜日韩欧美国产| 黄片小视频在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 人人妻,人人澡人人爽秒播| a在线观看视频网站| 特级一级黄色大片| av专区在线播放| 国产免费av片在线观看野外av| 51国产日韩欧美| 成人特级黄色片久久久久久久| 嫩草影视91久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 美女大奶头视频| 最后的刺客免费高清国语| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 亚洲国产色片| 国内精品一区二区在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 人妻久久中文字幕网| 久久国产精品影院| 宅男免费午夜| 51国产日韩欧美| 欧美日韩瑟瑟在线播放| www.999成人在线观看| 性欧美人与动物交配| 在线a可以看的网站| 国产精品久久久久久精品电影| 国产成人福利小说| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲,欧美精品.| 欧美一区二区亚洲| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美最黄视频在线播放免费| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲自偷自拍三级| 国产亚洲精品久久久com| 怎么达到女性高潮| av在线蜜桃| 少妇人妻一区二区三区视频| 露出奶头的视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品影院久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 九色成人免费人妻av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 韩国av一区二区三区四区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 有码 亚洲区| 在线观看午夜福利视频| 亚洲av不卡在线观看| 国产毛片a区久久久久| 国产高清激情床上av| 桃红色精品国产亚洲av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲美女黄片视频| 夜夜爽天天搞| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一区二区三区高清视频在线| 欧美性感艳星| 亚洲avbb在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲经典国产精华液单 | 欧美成人a在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产高清有码在线观看视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 麻豆久久精品国产亚洲av| 深爱激情五月婷婷| 日本黄色片子视频| 免费看光身美女| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美黑人巨大hd| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品91蜜桃| 露出奶头的视频| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 国产精品久久久久久久电影| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品伦人一区二区| av福利片在线观看| 日本黄大片高清| 九色成人免费人妻av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 禁无遮挡网站| 国产伦在线观看视频一区| 国产主播在线观看一区二区| 免费高清视频大片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品不卡国产一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 色吧在线观看| 精品久久久久久成人av| 神马国产精品三级电影在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美成人免费av一区二区三区| 熟女电影av网| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久性生活片| 在线观看免费视频日本深夜| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 中出人妻视频一区二区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 制服丝袜大香蕉在线| 成人一区二区视频在线观看| 热99在线观看视频| aaaaa片日本免费| 九九在线视频观看精品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产野战对白在线观看| 日本 欧美在线| 午夜视频国产福利| 欧美bdsm另类| av女优亚洲男人天堂| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产一区二区激情短视频| 久久伊人香网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲七黄色美女视频| 99精品在免费线老司机午夜| 国产主播在线观看一区二区| 国内精品久久久久久久电影| 国产老妇女一区| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美潮喷喷水| 香蕉av资源在线| 欧美中文日本在线观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产真实乱freesex| 国产毛片a区久久久久| 变态另类丝袜制服| 日韩欧美国产在线观看| 嫩草影视91久久| 性色avwww在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 久久久久久久久久黄片| 桃色一区二区三区在线观看| 久久热精品热| 亚洲国产精品成人综合色| 国产精品野战在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美中文日本在线观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美成人a在线观看| 成人精品一区二区免费| 88av欧美| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久久亚洲av毛片大全|