山東省芋花葉病毒病的田間調(diào)查及鑒定

高利利 姜珊珊 吳 斌 張 眉 王升吉 辛相啟（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東濟(jì)南 250100）

山東省芋花葉病毒病的田間調(diào)查及鑒定

高利利 姜珊珊 吳 斌 張 眉 王升吉 辛相啟*
（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東濟(jì)南 250100）

為明確芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）在山東芋種植區(qū)的發(fā)生和遺傳進(jìn)化，在山東濰坊、青島、煙臺、日照和臨沂等5個芋主栽區(qū)進(jìn)行調(diào)查，對采集樣品進(jìn)行病毒病病原鑒定、序列分析和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，芋花葉病毒的檢出率為55.9%，在5個地區(qū)皆有分布。5個DsMV分離物cp基因的核苷酸序列相似性為88.5%～91.9%，氨基酸序列相似性為93.4%～97.5%；與國內(nèi)外已報道代表性DsMV分離物cp基因的核苷酸與氨基酸的序列相似性分別為74.8%～99.4%、79.7%～99.1%。遺傳進(jìn)化分析顯示，DsMV山東分離物與日本分離物（Ds23）、中國分離物（ND和ZAN）和美國分離物（DsMV-U2）親緣關(guān)系較近，聚在同一分支。綜上，DsMV在山東省芋主栽區(qū)發(fā)生普遍，其cp基因序列之間變異相對較大。關(guān)鍵詞：芋花葉病毒；外殼蛋白基因；序列分析

芋（Colocasia esculenta Schott）又名芋頭、芋艿，為天南星科芋屬多年生宿根草本植物，因其球莖肉質(zhì)細(xì)膩、營養(yǎng)豐富、高產(chǎn)、耐貯運，在世界各地廣泛栽培（宋春鳳和徐坤，2004）。近年來，芋市場需求大大增加，特別是沿海地區(qū)芋及其加工品出口量迅速增加，已成為膠東半島重要的出口創(chuàng)匯蔬菜（沈鏑 等，2011）。但由于長期采用無性繁殖極易導(dǎo)致病毒積累，引起種性退化，產(chǎn)量及商品價值受到嚴(yán)重威脅。目前，芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）幾乎在我國芋產(chǎn)區(qū)皆有分布（劉文洪等，2004）。芋受侵染后產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣，久煮不爛，給生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失（韋傳寶 等，2009）。

DsMV為馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的成員，最早于1970年在美國發(fā)現(xiàn)（Zettler et al.，1970），隨后巴西、中國、印度、尼加拉瓜等國家相繼報道（Chagas et al.，1993；陳集雙和李德葆，1996；Pandit et al.，2001；Castro，2006）。我國廣東、福建、湖北、浙江、上海等地均有DsMV發(fā)生（范懷忠和孫芥菲，1984；陳集雙和李德葆，1996；杜紅梅和黃丹楓，2002）。DsMV一般通過3種方式傳播，在自然條件下主要通過多種介體昆蟲（蚜蟲）傳播，還可通過無性繁殖材料以及機(jī)械汁液摩擦傳播，其侵染的栽培植物和觀賞植物達(dá)16個屬以上（Chen et al.，2001）。感染DsMV的芋植株通常表現(xiàn)為葉片產(chǎn)生羽狀花葉或斑駁，皺縮向上卷曲，葉脈黃化和莖壞死等癥狀，可造成產(chǎn)量損失60%以上（Zettler et al.，1987）。

山東省是芋的主要生產(chǎn)地，為了了解DsMV在山東芋種植區(qū)的發(fā)生分布及遺傳進(jìn)化情況，本試驗對山東省5個芋主栽區(qū)進(jìn)行調(diào)查，采集芋病毒病疑似樣品，進(jìn)行病原鑒定、序列分析和遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建，旨在明確DsMV在山東栽培芋上的侵染及為害狀況，以期為該病毒的早期預(yù)警提供技術(shù)支持，為生產(chǎn)中該病害的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年8月在山東濰坊（昌邑、安丘）、青島（平度、即墨）、煙臺萊陽、日照莒縣、臨沂（莒南、沂水、沂南、蘭山區(qū)）等地區(qū)共采集芋病毒病樣品161份，同時采集大田中健康芋葉片作為陰性對照。

1.2 菌株、載體和生化試劑

TransZolTMPlant、Taq DNA聚合酶、dNTPs均購自TransGen Biotech公司；凝膠回收試劑盒購自GeneMark公司；HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自Vazyme Biotech公司；DH5α、pMD18-T、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司。

1.3 植物總RNA的提取及病毒基因擴(kuò)增

稱取采集的植物葉片0.1～0.2 g，嚴(yán)格按照TransZolTMPlant試劑盒說明書提取總RNA，利用隨機(jī)引物按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用DsMV cp基因的引物（P2F/P2R：5′-AGGTTGTATTGCAGGCAGATG-3′/5′-GCCAATA ACTGTGGCCTGTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增及cp基因克隆，擴(kuò)增片段為1 034 bp（Reyes et al.，2009）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，10×buffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，1 min，共35個循環(huán)；終延伸72 ℃，10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上檢測?；厥漳康臈l帶并連接到pMD18-T載體上，陽性克隆經(jīng)檢測后，送往青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

表1 用于序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析的DsMV分離物

1.4 序列比對分析

對所得DsMV分離物的cp基因序列進(jìn)行BLAST分析，選取NCBI上已發(fā)表的有代表性分離物的cp基因序列，利用DNAstar軟件中的Megalign進(jìn)行序列相似性比對，利用Mega 5.05軟件的Clustal W法進(jìn)行多序列比對以及利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)Bootstrap 1 000次重復(fù)進(jìn)行各分支置信度分析。所用序列信息詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋花葉病毒病的田間癥狀

對山東濰坊、青島、煙臺、日照、臨沂等芋栽培區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，田間芋植株花葉病毒病發(fā)生普遍，初步統(tǒng)計顯癥率在35%～55%之間，嚴(yán)重的地塊病株率在60%以上。癥狀主要為脈間褪綠黃化、葉片皺縮、葉脈褪綠、羽狀花葉、褪綠斑駁、葉片畸形向上卷曲和葉片上產(chǎn)生明亮褪綠黃斑等典型病毒病癥狀（圖1）。

圖1 芋花葉病毒病田間癥狀類型a，脈間褪綠黃化；b，葉片皺縮、葉脈褪綠；c，羽狀花葉；d，褪綠斑駁；e，葉片畸形向上卷曲；f，葉片上產(chǎn)生明亮褪綠黃斑。彩色圖版見《中國蔬菜》網(wǎng)站：www.cnveg.org。

2.2 山東芋花葉病毒的RT-PCR檢測

為了明確田間芋花葉病毒病的病原，在濰坊、青島、煙臺、日照及臨沂5個地（市）采集了161份病毒病疑似樣品，分別進(jìn)行RNA提取及RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，在90份樣品中檢測到DsMV cp基因（圖2）。各地區(qū)DsMV檢出率不同，平均檢出率為55.9%；其中煙臺萊陽檢出率最高，為92.3%；臨沂蘭山區(qū)檢出率最低，為30.0%（表2）。

2.3 山東DsMV cp基因的序列分析

對5個地區(qū)的DsMV分離物（煙臺：SD YT，臨沂：SD LY，青島：SD QD，日照：SD RZ，濰坊：SD WF）的cp基因進(jìn)行克隆和序列分析。5個分離物的cp基因全長均為942 bp。序列相似性分析顯示，5個分離物cp基因的核苷酸序列相似性為88.5%～91.9%，氨基酸序列相似性為93.4%～97.5%（表3），與國內(nèi)外已報道代表性DSMV分離物cp基因的核苷酸序列相似性為74.8%～99.4%，氨基酸序列相似性為79.7%～99.1%。本試驗所得分離物SD YT、SD LY、SD QD、SD RZ和SD WF與已報道的DsMV分離物cp基因的核苷酸序列相似性分別為75.3%～92.2%、76.4%～90.6%、76.3%～89.8%、76.0%～90.1%和74.8%～99.4%，氨基酸序列相似性分別為80.1%～96.5%、80.4%～98.4%、80.1%～96.5%、79.7%～96.5%和79.7%～99.1%。

表2 山東不同地區(qū)芋樣品DsMV RT-PCR檢測結(jié)果

表3 DsMV 不同分離物 cp的核苷酸（左下）和氨基酸（右上）序列相似性比較

對山東DsMV分離物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，選取國內(nèi)外有代表性的DsMV分離物的cp基因分別構(gòu)建核苷酸序列和氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3、4）。從核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果來看，DsMV分離物可分為2簇，其中山東分離物與日本分離物（Ds23）、中國分離物（ND和ZAN）和美國分離物（DsMV-U2）親緣關(guān)系較近，聚集為較大的1簇，與庫克群島分離物（CI-AT）、新西蘭分離物（DsMV2）和越南分離物（DsMV-VN/Ce1）等距離較遠(yuǎn)（圖3）。氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，山東5個分離物中，SD QD、SD YT、SD RZ親緣關(guān)系相近，與SDLY、SDWF親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)（圖4）。

圖3 DsMV分離物cp基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 DsMV分離物cp基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

芋花葉病毒病在我國主要芋產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，嚴(yán)重制約了我國芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗調(diào)查了山東省芋花葉病毒病的發(fā)生情況，并對該病毒進(jìn)行了分子鑒定。當(dāng)前國內(nèi)報道的可侵染芋的病毒僅有DsMV、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和芋桿狀病毒（Taro bacilliform virus，TaBV）（陳集雙和李德葆，1996；施世明 等，2013）。本試驗對采集的161個芋樣品進(jìn)行病原檢測，僅檢出DsMV，未檢測到其他病毒（結(jié)果未提供），由此表明山東省內(nèi)芋病毒病的病原為DsMV。161個樣品中DsMV檢出率為55.9%，調(diào)查采樣點5個地（市）皆能檢測到DsMV，表明DsMV已在山東省內(nèi)芋主栽區(qū)廣泛侵染，且不同地區(qū)、不同地塊田間發(fā)病率存在一定差異。所檢出的DsMV陽性樣品中癥狀表現(xiàn)多樣，主要為葉片脈間黃化、葉片皺縮葉脈褪綠、羽狀花葉、褪綠斑駁、葉片畸形上卷和葉片產(chǎn)生明亮褪綠黃斑等，與王彥芬等（2012）的報道一致。

研究表明，DsMV的不同分離物之間存在著高度的變異，且變異相對較大區(qū)域主要集中在DsMV的cp基因上。本試驗對山東5個地區(qū)的DsMV分離物cp基因進(jìn)行序列分析及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，5個山東分離物cp基因的核苷酸序列相似性為88.5%～91.9%，氨基酸序列相似性為93.4%～97.5%；與國內(nèi)外已報道的代表性DsMV分離物cp基因的核苷酸序列相似性為74.8%～99.4%，氨基酸序列相似性為79.7%～99.1%，表明DsMV的cp基因序列之間變異率較大，保守性相對較差，與Chen等（2001）的研究結(jié)果一致。通過比對發(fā)現(xiàn)，DsMV山東分離物與日本分離物（Ds23）、中國分離物（ND和ZAN）和美國分離物（DsMV-U2）同源性較高，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹中屬于同一分支，不同寄主種類或地理來源的分離物分別聚在不同的分支或亞分支中。

由于DsMV可以通過無性繁殖材料傳播，由此可以推斷，山東地區(qū)DsMV的發(fā)生可能是由于引種及種質(zhì)資源的調(diào)運等造成的。此外，山東地區(qū)蚜蟲發(fā)生嚴(yán)重，作為DsMV重要的傳毒介體（Abo El-Nil et al.，1977），該病也有可能隨蚜蟲傳入并傳播蔓延。因此，阻斷DsMV的傳播途徑、選用脫毒種苗和研發(fā)培育高抗品種等是防控芋病毒病的有效手段。由于DsMV分離物存在較高的分子變異，因此，應(yīng)正確理清山東DsMV分離物的分子結(jié)構(gòu)及基因變異情況，為該病害的流行分析及抗病育種工作奠定堅實的理論基礎(chǔ)。由于其癥狀多樣，容易混淆，及時高效準(zhǔn)確的鑒定已成為DsMV研究的一大重點。

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Field Investigation and Identification of Dasheen mosaic virus on Taro in Shandong Province

GAO Li-li，JIANG Shan-shan，WU Bin，ZHANG Mei，WANG Sheng-ji，XIN Xiang-qi*
（Institute of Plant Protection，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，Shandong，China）

In order to identify the occurrence and genetic evolution of Dasheen mosaic virus（DsMV）in taro planting area of Shandong Province，this paper investigated major taro planting areas including Weifang，Qingdao，Yantai，Rizhao and Linyi and carried out identification on pathogen of virus disease，made sequence analysis and genetic evolution analysis on the collected samples. The results showed that DsMV was the main pathogen and its detection rate was 55.9%. It was distributed in the above mentioned 5 regions. The nucleotide sequence similarities of cp gene between 5 DsMV isolates were 88.5%-91.9%，and amino acid sequence similarities were 93.4%-97.5%. The nucleotide and amino acid sequences similarities of cp gene between isolates from at home and abroad were 74.8%-99.4%，79.7%-99.1%，respectively. The analysis of phylogenetic relationships showed that DsMV Shandong isolates shared closer relation with that from Japan（Ds23），China（ND and ZAN）and America（DsMV-U2）. In conclusion，DsMV has occurred widely on taro in Shandong Province and has relatively large variation between cp qene sequences.

Dasheen mosaic virus；Coat protein gene；Sequence analysis

高利利，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物保護(hù)，E-mail：1196855876@ qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：辛相啟，男，副研究員，專業(yè)方向：植物病理，E-mail：xinxiangqi@126.com

2016-12-21；接受日期：2017-05-15

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303028），山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2016A09），山東省重點研發(fā)計劃項目（2016GNC111003）