云南切梢小蠹熱激蛋白40基因的克隆與序列分析

摘要[目的]克隆云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）熱激蛋白40基因，并進行序列分析，得到該基因的特征。[方法]采用RACE克隆技術，獲得云南切梢小蠹熱激蛋白40基因，并對該基因進行分析。[結果]試驗獲得的基因序列長為1 205 bp，開放閱讀框1173 bp，編碼氨基酸序列390個，編碼蛋白質的預測分子量為43.56 ku，等電點為7.35。該基因蛋白序列具有1個Amidation位點，2個天冬酰胺N末端糖基化位點，2個CAMP和CGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，3個酪蛋白激酶 Ⅱ 磷酸化位點，7個N末端十四烷基化位點，4個蛋白激酶C磷酸化位點，1個RGD細胞附著序列，1個DNAJ-1 結構域等熱激蛋白40所具有的典型特征。[結論]通過同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，云南切梢小蠹熱激蛋白40基因與家蠶（Bombyx mori）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）和東亞飛蝗（Locusta migratoria）的熱激蛋白40基因在氨基酸水平上一致性為20%～30%，它們的相似性均不高。雖然不同昆蟲Hsp40在進化過程中具有高度的保守性，編碼序列變異比較低，但是結構域差異與生物體適應外界環(huán)境有一定的關系。

關鍵詞云南切梢小蠹；熱激蛋白40；序列分析

中圖分類號S763.38文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0147-04

Abstract[Objective]To clone the gene of heat shock protein 40 in Tomicus yunnanensis and get the gene characteristics by sequence analysis.[Method]The gene of heat shock protein 40 in T.yunnanensis was obtained and analyzed by using rapid amplification of cDNA ends （RACE） method. [Result]This gene was 1 205 bp in length with opening reading frame （ORF） of 1 173 bp. The deduced amino acid sequence of T.yunnanensis Hsp40 revealed a protein of 390 amino acids.Its predicted molecular weight and isoelectric point were 43.56 ku and 7.35. It has several conservation amino acid sites including one Amidation site， two Nglycosylation sites， two CAMP and CGMP dependent protein kinase phosphorylation sites， three Casein kinase II phosphorylation sites， seven Nmyristoylation sites， four Protein kinase C phosphorylation sites， one RGD Cell attachment sequence， and one DNAJ1 Cell attachment sequence.[Conclusion]It shared 20%-30% amino acid identity with the Hsp40 of Bombyx mori，Tribolium castaneum，Liriomyza sativae and Locusta migratoria.Their similarity is not high. Although the Hsp40 of different insects is highly conserved in the evolution process， the variation of the coding sequence is relatively low， but there has a certain relationship between the structural domain differences and the organism that adapting to the external environment.

Key wordsTomicus yunnanensis；Heat shock protein 40；Sequence analysis

基金項目云南省林學一級學科博士點建設項目。

作者簡介樊曉紅（1989—），女，云南楚雄人，碩士研究生，研究方向：森林昆蟲學。

收稿日期2016-12-31

熱激蛋白（Heat shock proteins，Hsp）又稱熱休克蛋白或應激蛋白，是細胞或生物體受到脅迫后合成的一類高度保守的蛋白質。熱激蛋白作為細胞的重要組成成分，幾乎在所有的生物體都有存在。昆蟲體內(nèi)的Hsps在受到各種因素（如高溫、低溫、干燥、缺氧、殺蟲劑、重金屬、饑餓等）的刺激下，均可通過自身基因表達的改變，使機體熱激蛋白物質合成增多。根據(jù)序列相似性和蛋白分子量大小，可以將熱激蛋白超基因家族分為Hsp110、Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10和sHsp等8個家族，其中分子量在15 ku～30 ku的Hsp稱為小分子熱激蛋白（small heat shock protein，sHsp）[1-3]。Hsp廣泛存在于各種生物體內(nèi)，對生物個體的生長、發(fā)育和生存發(fā)揮著重要的角色[4-5]。無論如何進化，Hsp均具有2個特征，一是分子結構有很高的同源性；二是大多存在異構體，這是因為磷酸化、甲基化、糖基化、ADP、核進化等作用，導致Hsp異構體的形成，變構作用能影響Hsp的功能與代謝的穩(wěn)定性[6]。同時，它還具有分子伴侶、抗氧化、協(xié)同免疫、抗細胞凋亡、調節(jié)激素受體和某些蛋白激酶的特性。

熱休克蛋白40，即Hsp40是跨物種存在的高度保守的蛋白質家族。在細胞應激保護、蛋白質折疊、重折疊或聚集與降解、蛋白質移位以及分子伴侶等方面有重要作用。研究表明，Hsp40蛋白在生物體正常及熱激、鹽、重金屬、毒物代謝等脅迫下參與蛋白質的折疊、轉運、分泌和目標蛋白的降解等作用[7-9]。Hsp40能夠通過調節(jié)Hsp40/Hsp70的ATPase活性，使得Hsp70結合的底物多肽發(fā)生折疊，促進部分變性的蛋白復性（重新折疊）來保護脅迫損害的細胞并使其恢復正常功能[10-11]。除此之外，Hsp40的結構域DNA J能激活DnaK的ATP酶活性，從而幫助宿主細胞的λDNA進行復制，也能參與維持蛋白質結構的穩(wěn)定和變性蛋白的復性作用[12-14]。因此，Hsp40是一種與細胞多種生命活動密切相關的重要蛋白質[15]。

云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）屬于鞘翅目（Coleoptera）小蠹科（Scolytidae）切梢小蠹屬（Tomicus）。它是一種嚴重為害松屬樹種的危險性蛀干害蟲，是云南省補充植物檢疫對象。在云南主要為害云南松、思茅松、華山松、高山松等，特別是對云南松的為害最為嚴重。云南切梢小蠹已對全省松屬植物安全構成了嚴重威脅[16]。防治蠹害，保護云南松林，對于云南以及長江中上游地區(qū)的生態(tài)和經(jīng)濟建設以及可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義[17]。目前，對于云南切梢小蠹的研究主要集中在種群生態(tài)、驅避性、危害習性、生物學特性、寄主選擇性、抗病性、趨性及信息素誘導等。對膜翅目昆蟲體內(nèi)熱激蛋白的研究已經(jīng)被報道，如黑腹果蠅熱激蛋白，共有Hsp90、Hsp70、Hsp40、sHsp、Hsp60、TRiC等6個基因家族，不存在Hsp10和Hsp110家族[18]。但是對云南切梢小蠹體內(nèi)熱激蛋白的功能研究少有報道。因此，研究云南切梢小蠹熱激蛋白40具有重要意義。

該研究通過對云南切梢小蠹熱激蛋白40基因克隆與序列分析，利用生物信息學方法，進行蛋白序列分析、系統(tǒng)發(fā)育分析等，除了闡明Hsp40的結構和功能外，還有助于揭示昆蟲熱激蛋白與環(huán)境信息作用的機制，為探索新的害蟲防治途徑提供理論依據(jù)，并為后續(xù)研究該熱激蛋白各基因家族生理功能提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

將云南松有蟲孔的樹枝或樹干，用大刀或斧頭劈開，采集云南切梢小蠧幼蟲。

1.2主要試劑和藥品

總RNA提取所用的TRIzol Reagent購于Invitrogen公司，Advantage 2 PCR kit（Clontech）購于Takara公司，pGEM-T-easy載體購于Promega公司，陽性克隆送南京金思特公司測序。

1.3總RNA的提取及cDNA第一條鏈合成

挑取云南切梢小蠹5頭，提取其總RNA，提取過程依照TRIzol試劑盒（Invitrogen）說明書進行。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的純度和濃度，將總RNA保存于-80 ℃?zhèn)溆?。cDNA第一條鏈的合成按Advantage 2 PCR kit試劑盒（TaKaRa）說明書進行，將第一條鏈cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴增

以第一條鏈cDNA作為模板，利用合成的引物進行PCR反應。擴增體系為25 μL，其中包含2 μL cDNA模板。擴增條件：94 ℃預變性3 min；然后94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸10 min。

1.5PCR產(chǎn)物的克隆與測序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶經(jīng)切膠回收純化，然后連接到pGEM-T-easy載體，并轉化到感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選以及質粒PCR鑒定后選取陽性克隆送南京金思特公司測序。

1.6序列分析

核苷酸序列的翻譯和氨基酸序列的比對分析分別使用Genetyx；通過NCBI網(wǎng)站，對序列進行BlastX比對分析，下載蛋白質序列，利用ClustalX 1.83軟件進行多序列比對；對蛋白信號肽的預測使用SignalP分析，結構域預測采用Motifscan分析。

45卷5期樊曉紅云南切梢小蠹熱激蛋白40基因的克隆與序列分析

2結果與分析

2.1cDNA克隆及序列分析

克隆獲得的Hsp40基因cDNA長度為1 205 bp，翻譯的起始密碼子為26位的ATG，終止密碼子AAT位于1 198位，開放讀框長1 173 bp（圖1）。該基因編碼390個氨基酸，預測分子量和等電點分別為43.56 ku和7.35，SignalP預測該蛋白不具信號肽，Motifscan分析發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列中潛在1個Amidation位點（Amidation site）（KGKK198-201），2個天冬酰胺N末端糖基化位點（Nglycosylation site）（NCSL115-118和NLTE266-269），2個CAMP和CGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點（CAMP and CGMP dependent protein kinase phosphorylation site）（RRCS178-181和RKGS245-257），3個酪蛋白激酶II（CKII）磷酸化位點（Casein SSDD373-376），7個N末端十四烷基化位點（Nmyristoylation site）（GIKEGG71-76、GGGGGM77-82、GGGGSR96-101、GAGGAK142-147、GMKDGD216-221、GLEPGD234-239、GGPQGV380-385），4個蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylation site）（TKK126-128、SCK196-198、TRK253-255和SRK334-336），1個RGD細胞附著序列（RGD Cell attachment sequence）（RGD318-320），1個DNAJ-1結構域（DNAJ-1 Cell attachment sequence）（FKLISDAYEVLSDPKKREVY45-64）。

2.2同源性比較

用ClustalX 1.83對Hsp40與其他昆蟲Hsp40的氨基酸序列比對結果見圖2。從圖2可以看出，云南切梢小蠹Hsp40與其他昆蟲Hsp40的相似性不是很高，其中與家蠶（Bombyx mori）、 赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae）、 東亞飛蝗（Locusta migratoria）的相似度分別為25%、28%、27%和26%。

3結論與討論

Hsps家族成員在原核生物與真核生物中普遍存在，進化程度相對保守。在生理狀態(tài)下，Hsps多數(shù)作為分子伴侶，幫助蛋白質的正確折疊、移位、維持降解。當機體受到理化因素或者各種生物因素刺激時，Hsps的表達量往往會大幅度提升，參與細胞結構維持、更新、修復、免疫等諸多環(huán)節(jié)，以提高細胞抵抗外來刺激的能力[19]。鑒于其免疫保護作用，熱激蛋白家族一直是熱門的研究對象[20]。

Hsp40首先在原核細胞中被發(fā)現(xiàn)，由2個結構域和C端的DNA J-C結構域構成。DNA J結構域高度保守，在蛋白質翻譯、折疊、去折疊、轉移和降解中扮演著重要的角色，其作用是激活Hsp70 C端EEVD基序的ATP酶活性。Hsp40基因沉默可能會降低Dna K/Hsp 70蛋白的活性，進而無法及時促進變性蛋白的復性[21-22]。當機體受到脅迫損害時，細胞損傷不能被及時修復，降低害蟲應對外界脅迫時產(chǎn)生的蛋白修復能力，從而達到控制害蟲的目的。DNA J家族也被稱為J蛋白家族，DNA J家族成員HSPA/DNA K蛋白協(xié)作，促進ATP向ADP的水解，從而幫助Hsp70伴侶蛋白鎖定其所結合的蛋白質底物，形成三聚體預防未折疊底物的聚集[20]。DNA J結構域大小為70個氨基酸，由1個環(huán)區(qū)和4個螺旋構成，環(huán)區(qū)位于第2、3螺旋之間，有1個高度保守的HPD基序[23]。除以上保守區(qū)域外，DNA J家族成員還含有其他決定著DNA J蛋白功能差異的結構域，如哺乳動物細胞中的DNA J蛋白ERdj5/JPDl具有類二硫鍵異構酶功能域，能夠促進內(nèi)質網(wǎng)蛋白形成二硫鍵[24-25]。

該研究利用RACE技術，從云南切梢小蠹基因庫中克隆獲得1個Hsp40全長基因。云南切梢小蠹Hsp40與家蠶、赤擬谷盜、美洲斑潛蠅、東亞飛蝗Hsp40氨基酸序列的一致性分別為25%、28%、27%和26%，可以看出它們的相似性均不高，編碼氨基酸序列有多個保守的氨基酸位點，這體現(xiàn)了不同昆蟲Hsp40在進化過程中具有高度的保守性。盡管熱激蛋白序列保守，編碼序列變異比較低，但近期已有研究表明，熱激蛋白基因序列變異，而且這類變異與生物體對逆境脅迫的適應間存在著一定的相關。該試驗利用Motifscan分析云南切梢小蠹Hsp40發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列中潛在1個DNA J-1結構域（DNA J1 Cell attachment sequence），這與李云華等[26]的研究相一致，而且進一步證實了熱激蛋白在進化上具有高度的保守性。此次研究云南切梢小蠹與熱激蛋白40的作用機制，可以通過改變或者調控一些作用因子，從而尋找到控制蛀干害蟲的新方法，為今后的害蟲防治提供理論基礎和新途徑。

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