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      光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

      2017-05-30 10:48:04趙偉宋歌
      畜牧獸醫(yī)科學(xué) 2017年7期
      關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌

      趙偉 宋歌

      摘要:本試驗(yàn)對(duì)金葡菌進(jìn)行培養(yǎng)并加入藥物觀察來測(cè)定影響因子。分光光度計(jì)的測(cè)定數(shù)據(jù)表明,不同濃度的光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。

      關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌;生物被膜;光甘草定;分光光度計(jì)

      中圖分類號(hào):S859.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):2096-3637(2017)07-0006-03

      和很多的致病菌一樣,金黃色葡萄球菌也可以在其表面形成一層生物被膜,金黃色葡萄球菌的生物被膜形成以后,其形態(tài)特征,以及生理變化都會(huì)發(fā)生很復(fù)雜的變化,生物被膜由很多大分子物質(zhì)組成,它能使包裹在內(nèi)部的細(xì)菌免受外界不良環(huán)境的干擾和破壞,從而對(duì)細(xì)菌起到保護(hù)作用[1]。所以,要想防治或者治療金黃色葡萄球菌的感染,就要先從生物被膜入手。

      1金葡菌生物膜系統(tǒng)簡(jiǎn)介

      金黃色葡萄球菌之所以難以防治,難以治療,是因?yàn)樵诟腥窘瘘S色葡萄球菌以后,病菌會(huì)形成一個(gè)復(fù)雜細(xì)菌生物被膜。細(xì)菌生物被膜是一層包裹在細(xì)菌外面的極其復(fù)雜和嚴(yán)密的膜[2]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,在生物膜的形成起始階段,細(xì)菌與細(xì)菌的粘附是生物膜形成的關(guān)鍵,這個(gè)階段很大程度上受到胞外DNA(eDNA)作用和影響。在聚集階段發(fā)揮作用的是多糖PIA[3]。PIA不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)菌之間相互依附粘連,還能促進(jìn)細(xì)菌的分化增值,有此形成多層的細(xì)胞團(tuán)塊,進(jìn)而形成生物被膜[4]。

      基因ica操縱子是細(xì)胞間多糖粘附素合成的基礎(chǔ)。它有五個(gè)基因串聯(lián)組成,分別是icaA,icaD,icaB,icaC,icaR。其中發(fā)揮最重要作用的是icaA[5]。胞外DNA能夠促進(jìn)生物被膜的形成,細(xì)胞質(zhì)水解酶可以通過裂解細(xì)菌將胞外DNA釋放到細(xì)菌外界加強(qiáng)生物被膜的形成。并且細(xì)胞質(zhì)水解酶受cidA的調(diào)控,所以cidA間接的對(duì)生物被膜的形成發(fā)揮重要的作用。然而如果cidA基因缺失,就會(huì)降低細(xì)菌的裂解,進(jìn)而減少胞外DNA的釋放,間接的對(duì)生物被膜的形成起到抑制作用。由此可見,胞外DNA是否能夠釋放,很大程度上取決于cidA的調(diào)節(jié)。從另一方面來說,基因cid操縱子和ica操縱子都受到agr和sar兩個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響[6]。由此,agr和sar是金葡菌研究中最重要的研究系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)表明,agr和sar系統(tǒng)可以通過影響cid的表達(dá)來控制細(xì)菌自溶,通過調(diào)控ica來影響生物膜的形成。

      要想控制或抑制生物被膜,首先要做的是對(duì)生物被膜形成的研究和分析。近年對(duì)于生物被膜的研究,大多是通過改變不同環(huán)境或藥物對(duì)生物被膜的作用,然后對(duì)生物被膜進(jìn)行測(cè)定,通過得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果分析討論,從而得出對(duì)生物被膜形成影響最大的因素,進(jìn)而探測(cè)生物被膜形成的機(jī)理。在金黃色葡萄球菌生物被膜研究的實(shí)驗(yàn)中,通過甲基葡萄糖的研究[7]說明生物被膜的主要組成是多糖PIA,而且PIA的合成,受細(xì)菌總糖量的影響。對(duì)于金黃的葡萄球菌的治療和防治,要從生物被膜開發(fā),尋求的藥物也需要以對(duì)PIA和eDNA有影響為基本要素。在近年的實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中,甘草系列的研究發(fā)展迅速,并且可能滿足影響的條件,本實(shí)驗(yàn)旨在檢驗(yàn)光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響[8]。

      2研究的目的和意義

      本實(shí)驗(yàn)將光甘草定等樣品溶于PBS溶液制成液體藥物,加入到具有相同狀態(tài)金黃色葡萄細(xì)菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),制備成不同終濃度(有空白對(duì)照)的液體進(jìn)行孵育作用,作用結(jié)束后用結(jié)晶紫染色,用分光光度計(jì)測(cè)出各孔的吸光度,從數(shù)據(jù)的不同反映出藥物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響。進(jìn)一步探索光甘草定在治療藥物研發(fā)上的應(yīng)用,為人類身體健康和食品安全方面的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

      3材料與方法

      3.1材料

      3.1.1材料來源

      金黃色葡萄球菌和光甘草定樣品。

      3.1.2試驗(yàn)所用器材及儀器

      96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、火柴、平皿若干、1.5mlEP管若干、10ul槍頭若干、200ul槍頭若干、1ml槍頭若干、1.5mlEP管架若干、細(xì)菌培養(yǎng)瓶若干、大小瓶塞若干、酒精燈、電磁爐、剪刀、鑷子、接種環(huán)、錐形瓶若干、量筒、250ml試劑瓶若干、100ml試劑瓶若干、數(shù)碼鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)、CO2培養(yǎng)箱(青島龍杰儀器公司)、數(shù)碼電熱恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9082ME上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、恒溫?fù)u床、高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、微量移液器一套(規(guī)格:0.5~10?l、20~200?l、100~1000?l,購(gòu)自大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)、電子天平(購(gòu)于北京賽多利斯天平有限公司)、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、離心管、一次性手套,-20℃冰箱、4℃冰箱、醫(yī)用膠帶、脫脂棉、封口薄膜等。

      3.1.3試驗(yàn)所用試劑

      胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)(購(gòu)自美國(guó)BD公司)、瓊脂粉(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠)、革蘭氏染色劑(草酸銨結(jié)晶紫,碘液,95%酒精,石碳酸復(fù)紅)、香柏油、二甲苯、蒸餾水、自來水、75%醫(yī)用酒精、新潔爾滅消毒液、無水乙醇、PBS液(河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備)、苯酚、結(jié)晶紫溶液、氯仿、TEN緩沖液、異戊醇LB、EDTA、醋酸鈉、液體培養(yǎng)基(河南科技大學(xué)制備)等。

      3.2主要試劑的配制液

      3.2.1 10mg/ml光甘草定溶液:PBS液3ml,加0.03g光甘草定震蕩溶解。

      3.2.2 LB培養(yǎng)液:LB液100ml,蛋白胨1g,酵母0.5g,Nacl1g。

      3.2.3結(jié)晶紫溶液:結(jié)晶紫0.04g,蒸餾水10ml震蕩溶解。

      3.2.4 EDTA。

      3.2.5 TEN緩沖液。

      3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

      3.3.1檢測(cè)eDNA的方法

      按上述方法培養(yǎng)生物膜,用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600下細(xì)菌濃度,按Rice等人(2007)的方法提取并檢測(cè)eDNA。加入0.5MEDTA預(yù)冷1h;用700μl50mMTEN緩沖液(Tris-HCl,10mMEDTA,500mMNaCl)重懸生物膜,轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中,4℃,18000rpm離心5min;將上清轉(zhuǎn)入新的離心管,加入300μlTE緩沖液,加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1);4℃,12000rpm離心10min,取上清,用氯仿∶異戊醇(24∶1)再次萃取;取水相,加入3倍體積的冷乙醇和1/10體積的醋酸鈉,混勻后-20℃過夜;4℃,18000rpm離心20min,去上清,用70%冷乙醇洗滌,空氣中風(fēng)干后,加入20μlTE緩沖液溶解;用NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280的吸光度比,eDNA的相對(duì)表達(dá)量用單位生物膜內(nèi)eDNA的含量表示。

      3.3.2甘草測(cè)定的方法

      ①用PBS將光甘草定配制成濃度為10mg/ml。

      ②將金黃色葡萄球菌接種與LB培養(yǎng)基37℃震蕩過夜第二天取培養(yǎng)液用LB培養(yǎng)液稀釋10稀釋后,取200μL稀釋后的菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,放于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

      ③往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入光甘草定終濃度為10μL/ml,20μL/ml,50μL/ml,100μL/ml,200μL/ml同時(shí)做空白對(duì)照孔,每孔重復(fù)2次,分別作用,2h,4h,6h和8h后用PBS洗去浮游菌,洗3次,加入0.04%結(jié)晶紫染色30min,用自來水洗去浮色,待膜干后,每孔用200μL乙醇溶解,于570~590nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。

      3.3.3病菌接種

      把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開放入試管,菌(液體)、LB液體培養(yǎng)基,消毒滅菌20~30min、然后,點(diǎn)燃酒精燈,在酒精燈旁完成實(shí)驗(yàn),消毒灼燒空試管口,消毒培養(yǎng)液瓶口、到入1/3左右,打開裝菌種的離心管、用接種環(huán)灼燒消毒,沾菌、加入試管、灼燒用過的接菌環(huán)、試管蓋上紙蓋子封口,用報(bào)紙包好,放入THZ-92C氣浴恒溫震蕩器過夜(37℃12h),整理超凈工作臺(tái)。

      3.3.4細(xì)菌的稀釋

      將復(fù)蘇好的細(xì)菌從恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱內(nèi)取出,觀察小試管內(nèi)的細(xì)菌的情況,細(xì)菌的形態(tài),色澤,透明度等,在凈化操作臺(tái)中,取錐形瓶加入3ml菌液。再加入27mlLB培養(yǎng)液,用200μL移液器加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),培養(yǎng)48h。

      3.3.5封口保藏

      將加入了200μL稀釋菌液的96孔板,用保鮮膜纏繞,確保96孔板上下兩個(gè)半殼之間的空隙被密封,在底部放置濕潤(rùn)的毛巾,置于特定的容器內(nèi),放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)48h。

      4結(jié)果及分析

      4.1 eDNA測(cè)定的結(jié)果

      將作用2h的實(shí)驗(yàn)板經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理,然后測(cè)定其數(shù)據(jù)取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,并做出最溶度增大的數(shù)據(jù)柱狀圖,作圖如下:

      4.2甘草作用的結(jié)果

      將生物膜用結(jié)晶紫試劑染色以后,對(duì)樣本進(jìn)行處理完成,放入分光光度計(jì)中進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定后,求相同時(shí)間同一濃度數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,作出柱狀圖如下:

      4.3分析

      4.3.1 eDNA的測(cè)定

      eDNA的相對(duì)表達(dá)量就是對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成多少的直接反映。所以從圖(1)的變化可以看出,數(shù)據(jù)逐漸減小,說明同一作用時(shí)間,隨著作用濃度的增大,光甘草定對(duì)金葡菌的抑制作用也在增強(qiáng)。

      4.3.2光甘草定圖(2)

      光甘草定實(shí)驗(yàn)板的測(cè)定數(shù)據(jù)有明顯的浮動(dòng)和變化,說明隨著光甘草定的濃度的不同,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明顯在減小,柱狀圖也在平穩(wěn)的下降,實(shí)驗(yàn)表明光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌的形成有明顯的抑制作用,并且隨著光甘草定的濃度的增大,金黃色葡萄球菌受抑制的作用就更加明顯。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),抑制效果也在增強(qiáng)。光甘草定歲生物被膜的影響機(jī)理可能是光甘草定的抗菌抗癌作用。柱狀圖越來越低是因?yàn)殡S著濃度的增加細(xì)菌受到的影響作用也越來越大,生物被膜的形成越來越少。因此實(shí)驗(yàn)表明,光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌的形成有明顯的抑制作用。

      5討論

      甘草是一種有益的中草藥,味甘,性緩。用于很多疾病的防治和治療。而且分布廣泛。在我國(guó)分布在新疆寧夏等地區(qū)。甘草是天然活性物質(zhì),能夠增強(qiáng)人體免疫力,對(duì)炎癥,腫瘤等疾病具有不同程度的防治和治療效果。在修復(fù)自身免疫方面和抗病毒方面也有一定的效果。

      經(jīng)過實(shí)驗(yàn),任何實(shí)驗(yàn)濃度的光甘草定均表現(xiàn)出的是對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用。通過數(shù)據(jù)的平穩(wěn)降低和曲線的持續(xù)下降,表明光甘草定對(duì)生物被膜有持續(xù)的影響作用,并且還隨著濃度的增加,抑制作用還越來越強(qiáng)。進(jìn)過近年的實(shí)驗(yàn)研究成果觀察,抑制的機(jī)理可能是影響可細(xì)菌的生長(zhǎng)。有實(shí)驗(yàn)證明[9],光甘草定對(duì)酪氨酸酶的活性有一定的影響作用。因此有可能是在細(xì)菌的新陳代謝階段,某一種或者某幾種酶活性受到干擾,導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受阻,因此生物被膜的形成被影響。也有可能是的結(jié)構(gòu)到破壞。導(dǎo)致細(xì)菌無法完成特定的生理過程,因此無法完成正常的生物被膜的構(gòu)建。也有很多實(shí)驗(yàn)證明光甘草定具有一定程度的抗菌和抗癌作用。因此光甘草定可能還有其他的影響生物被膜形成的機(jī)理。

      6結(jié)論

      光甘草定,10~200μL/ml濃度梯度的光甘草定,隨著濃度的增加對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制作用增強(qiáng)。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),抑制作用增強(qiáng)。

      參考文獻(xiàn)

      [1]陳秋云,韓北忠,李春雷,金黃色葡萄球菌生物被膜在不銹鋼表面的形成及其對(duì)二氧化氯的敏感性[J],中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,9:10-13.

      [2]段韻涵,韓北忠,楊葆華等,培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長(zhǎng)的影響[J],中國(guó)釀造,2003(3):17-20.

      [3]ChristofvonEiff,GeorgP,ChristineH. Pathogenesisofinfections duetocoagulasenegativeStaphylococci.LancetInfectDis,2002,2:677-685.

      [4]FrebourgNB,LefebvreS,BaertS,etal.PCR-basedassayfordiscriminationbetweeninvasiveandcontaminatingStaphylococcusepidermidisstrains.JClinMicrobiol,2000,38(2):877-880.

      [5]HeilmannC,GerkeC,Perdreau-RemingtonF,etal.CharacterizationofTn917insertionmutantsofStaphylococcusepidermidisaffectedinbiofilmformation.InfectImmun,1996,64(1):277-282.

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      [9]馬海樂,樊金玲.光甘草定檢測(cè)提取純化及其抑制酪氨酸酶活性的研究,河南科技大學(xué),河南,2011,5:1-2.

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