酸堿預(yù)處理后酶解提升丹參藥渣中丹參酮類成分的提取效率研究

戴新新+沈飛+宿樹蘭+張森+郭盛+江曙+錢大瑋+段金廒

[摘要]通過酸堿預(yù)處理丹參藥渣，并利用纖維素酶降解，比較不同處理方法對(duì)丹參酮類成分提取效率的影響，以期為丹參藥渣中丹參酮類成分的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，未經(jīng)酸堿預(yù)處理的丹參藥渣中，當(dāng)酶c濃度為6U·mL^-1，酶解4.5d時(shí)可使大部分纖維素降解，所得葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為59.74mg·g^-1。對(duì)不同預(yù)處理方法評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)堿預(yù)處理.纖維素酶c降解后的效果最佳，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)119.50 mg·g^-1，相同濃度纖維素酶c酶解的酸預(yù)處理藥渣次之。丹參酮的提取量經(jīng)酶液降解后，與常規(guī)非酶法處理相比，丹參酮Ⅱ_A提取量提高了82.54%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.451 mg·g^-1；丹參酮Ⅰ提取量提高了81.82%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.373mg·g^-1；隱丹參酮提取量提高了64.4%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.080mg·g^-1；二氫丹參酮Ⅰ提取量提高了61.3%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)0.6012mg·g^-1。通過酸堿預(yù)處理與纖維素酶降解相結(jié)合的方法可有效提高丹參藥渣中丹參酮類成分的提取效率，該方法具有可操作性和實(shí)用性，有利于提升丹參藥渣中丹參酮類資源性化學(xué)物質(zhì)的利用效率。

[關(guān)鍵詞]丹參藥渣；丹參酮；酸堿預(yù)處理；酶解

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltior-rhiza Bge的干燥根和根莖，主產(chǎn)于山東、河北、安徽、河南等地，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰功效。用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)、冠心病、心絞痛、心肌梗塞等癥的治療。丹參酮（tanshinone）是丹參中脂溶性松香烷型二萜類化合物，具有廣泛的藥理作用和臨床應(yīng)用價(jià)值，受到醫(yī)藥學(xué)家的高度關(guān)注。目前，丹參類注射液制備生產(chǎn)過程主要采用水提醇沉工藝，致使脂溶性的丹參酮類成分殘留于藥渣中，未得到充分利用導(dǎo)致丹參資源性化學(xué)物質(zhì)的浪費(fèi)和資源利用效率低，同時(shí)造成環(huán)境污染。

此外，丹參藥渣中富含纖維素類、半纖維素類以及木質(zhì)素類成分，如能將纖維類物質(zhì)轉(zhuǎn)化降解成為糖類物質(zhì)，既可提升丹參藥渣中丹參酮類成分的提取效率，又可將其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化開發(fā)動(dòng)物飼料、肥料等，對(duì)于實(shí)現(xiàn)丹參資源的多途徑、多層次綜合利用具有重大的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞壁是阻礙代謝產(chǎn)物溶出的主要因素，因此，采用纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行降解，可在平衡生產(chǎn)成本和提取效果的基礎(chǔ)上，確定一套溫和、環(huán)保、節(jié)能的丹參酮提取工藝。

本文在前期研究基礎(chǔ)上，采用纖維素酶降解的方法對(duì)丹紅注射液生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的丹參藥渣進(jìn)行預(yù)處理后，提取丹參酮類成分，以期提升丹參酮類成分的提取效率，從而為丹參藥渣的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

美國Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，Waters2998 PDA檢測(cè)器，Waters 2424型ELSD檢測(cè)器（Waters公司），Empower數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，F(xiàn)W80型高速萬能粉碎機(jī)（天津），DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海），TDL-80-2B型離心機(jī)（上海），KH-500型超聲波清洗儀器（昆山），ML204/02、MS-205電子天平（上海），IS-RDV1型恒溫振蕩器（美國精騏），Perkin Elmer酶標(biāo)儀（Enspire公司）。

甲醇、甲酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、3，5.二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、苯酚、羥甲基纖維素鈉、硫酸均為分析純，乙腈（美國TEDIA公司）為色譜純?cè)噭?。葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院）、二氫丹參酮I（南京春秋生物工程有限公司，批號(hào)20140516）、丹參酮I（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110867-200406）、隱丹參酮（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110852300806）、丹參酮Ⅱ_A（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110766-200619），纖維素酶分別為自制酶液（纖維素酶A）和國產(chǎn)纖維素酶（纖維素酶B）以及購自SIG-MA公司的纖維素酶（纖維素酶C）。水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。丹參藥材與丹參固體廢棄物在2016年3月收集于菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為丹紅注射液生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的丹參固體廢棄物。

2方法

2.1纖維素酶活力的測(cè)定

2.1.1試劑的配制3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑的配制：10g氫氧化鈉，10g3，5.二硝基水楊酸，200g酒石酸鉀鈉，0.5g亞硫酸鈉，2g苯酚，純水定容至1000mL，避光保存，1周后可用。

試劑配制：0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液（CMC），0.1mol·L^-1pH4.5的乙酸.乙酸鈉緩沖液，1.05 g·L^-1的葡萄糖溶液，0.1mol·L^-1pH4.8的檸檬酸.檸檬酸鈉緩沖液。

酶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取纖維素酶A，B，C各2g，精確至0.0001g，加入50mL的檸檬酸鹽緩沖液，從中取出1mL再定容至100mL，（以保證稀釋后的纖維素酶活力應(yīng)在0.04～0.08 U·mL^-1）待測(cè)。

2.1.2酶活力葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的葡萄糖于6支試管中，用超純水稀釋至1mL，加DNS顯色劑3mL，搖勻后沸水浴中煮沸10Min，冷卻，定容至10mL，充分混勻。在520nm波長(zhǎng)下各管溶液的吸光度并記錄結(jié)果。以葡萄糖質(zhì)量濃度（g·L^-1）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3纖維素酶活力測(cè)定

取2.1.1項(xiàng)下酶液各1mL，分別加入0.5%CMC 3mL，在50℃水浴中酶解30min，沸水浴10min使酶失活，得到酶解液，冷卻后加入3mL顯色液，沸水浴10min，冷卻加水定容至10mL，在550nm處測(cè)定吸光度。纖維素酶單位的定義：在50℃，pH 7.0的條件下，每30min分解羧甲基纖維素鈉釋放1mg葡萄糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位U。纖維素酶活力的計(jì)算公式見文獻(xiàn)。

2.1.4空白對(duì)照的測(cè)定

取1mL酶液，沸水浴5min，冷卻后加入0.5%CMC 3mL，與樣品同時(shí)放入50℃水浴30min。其他操作同2.1.3項(xiàng)下進(jìn)行。

2.2酶解纖維素產(chǎn)生葡萄糖的測(cè)定方法

2.2.1丹參藥渣預(yù)處理將水提取后的丹參藥渣在60℃溫度下烘干，取干燥藥渣打粉，過20目篩，備用。

2.2.2丹參藥渣酸、堿預(yù)處理方法

采用4%硫酸與丹參藥渣10：1（mL·g^-1）混合，攪拌均勻后，90℃水浴1.5 h；采用10%氫氧化鈉溶液與丹參藥渣6：1（mL·g^-1）混合，攪拌均勻后，90℃水浴1.5h。將酸、堿預(yù)處理后的丹參藥渣用蒸餾水洗滌至中性，然后在60℃下烘干，研磨至均勻的顆粒大小，備用。

2.2.3樣品的配制將纖維素酶溶解于檸檬酸.檸檬酸鈉緩沖液中，藥渣與乙酸.乙酸鈉緩沖溶液混合，根據(jù)相應(yīng)條件加入不同量的酶液，置于50℃，180 r·min^-1的恒溫?fù)u床內(nèi)進(jìn)行酶解，定時(shí)取樣測(cè)定。

2.2.4酶濃度的影響加入一定量的酶液，將反應(yīng)體系中底物酶的濃度配制成1.25，2.5，3.75，5，7.25 U·mL^-1。反應(yīng)一定時(shí)間后，取出加入3mLDNS，沸水浴5min，終止反應(yīng)，然后放入冷水中，在8000 r·min^-1下離心10min，取上清液，過0.22μm的濾膜，測(cè)定葡萄糖的含量。

2.2.5酶解反應(yīng)時(shí)間的影響加入一定量的酶液，反應(yīng)時(shí)間分別為36，60，84，108，132，156 h取出加入3 mL DNS，沸水浴5min，終止反應(yīng)，然后放入冷水中，在8 000 r·min^-1下離心10min，取上清液，過0.22μm的濾膜，測(cè)定葡萄糖的含量。

2.2.6葡萄糖測(cè)定的色譜條件檢測(cè)器：EISD，色譜柱：XBridge Amide（4.6mmx150mm，3.5μm），柱溫30℃，流速0.8mL·min^-1，進(jìn)樣量10μL，以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）80：20為流動(dòng)相，等度洗脫，增益10，噴霧器加熱，動(dòng)力60%，漂移管溫度80℃，氣體壓力40 psi（1 psi=6.89 kPa）。

2.3丹參酮類化學(xué)成分分析方法

2.3.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取二氫月參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A對(duì)照品適量，用甲醇配成質(zhì)量濃度分別為0.024 8，0.152，0.209，0.126 g·L^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.2樣品的配制取經(jīng)過纖維素酶降解后的藥渣和未經(jīng)過降解的藥渣，精密加入甲醇溶液30mL，精密稱定，浸泡16h后在30℃，100kHz下超聲30min，稱量補(bǔ)足失重，過濾，濾液在8000r·min^-1。下離心10min，取上清液，過0.22μm的濾膜，進(jìn)樣。

2.3.3色譜條件色譜柱BDS HYPERSIL C₁₈（4.6mmX250 mm，5μm），柱溫30℃，流速1mL·min^-1，進(jìn)樣量10μL，以乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～8min，15%A；8～9min，15%～28%A；9～20min，28%A；20～22min，28%～54%A；22～28min，54%A；37～38min，54%～60%A；38～43min，60%～68%A；43～48min，68%～70%A；48～52min，70%～15%A），色譜圖見圖1。

2.3.4線性范圍的考察取適量二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A對(duì)照品，分別進(jìn)樣1，2，5，10，20μL；按2.3.3色譜條件進(jìn)樣記錄峰面積積分值。以峰面積積分值y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度x為橫坐標(biāo)，得二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A的回歸方程。

2.3.5重復(fù)性試驗(yàn)按照上述方法制備6份樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ。的RSD。

2.3.6 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品貯備液10ixL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A色譜峰峰面積，計(jì)算得RSD。

2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批對(duì)照品溶液，每隔4h測(cè)定1次，測(cè)定6次，最終得到二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A的RSD。

2.3.8回收率試驗(yàn)

精密稱定已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品3份，加入適量對(duì)照品，混勻，按照2.3.3項(xiàng)方法處理，測(cè)定有效成分的含量，計(jì)算加樣回收率。

2.4樣品分析測(cè)定

精密吸取樣品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，計(jì)算樣品中二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ_A的含量。

3結(jié)果與分析

3.1纖維素酶活力的測(cè)定

3.1.1酶活力葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以光密度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（g·L^-1）為橫坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)曲為Y=1.7224X-0.000 3，R²=0.9940，線性范圍210～1050μg。

3.1.2樣品酶活力測(cè)定通過檢測(cè)與計(jì)算，纖維素酶A的酶活力為1.03 U·mg^-1，纖維素酶B為1.35U·mL^-1，纖維素酶C的酶活力為50.02U·mL^-1。

3.2纖維素降解后葡萄糖含量測(cè)定

3.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以HPLC-ELSD方法檢測(cè)到的峰面積取對(duì)數(shù)后為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的回歸方程為Y=0.451 8X+5.910 9，R²=0.990 1。線性范圍1.05～21.00μg。此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，可用于葡萄糖的測(cè)定，色譜圖見圖2。

3.2.2酶的影響

通過不同酶濃度對(duì)丹參藥渣進(jìn)行酶解處理，所用酶為纖維素酶C，當(dāng)?shù)孜锩笣舛壬邥r(shí)，葡萄糖的含量也隨著升高，酶在1.5～3U·mL^-1時(shí)降解得到葡萄糖為14.91～43.19 mg·g^-1。當(dāng)酶為4.5 U·mL^-1時(shí)，葡萄糖的含量趨于平穩(wěn)，當(dāng)酶為6 U·mL^-1時(shí)，葡萄糖為59.74mg·g^-1，由此可知，最適宜酶底物為6 U·mL^-1，見圖3。

3.2.3酶解時(shí)間對(duì)纖維素降解率和葡萄糖濃度的影響纖維素酶C與底物的作用時(shí)間過長(zhǎng)或過短都不能準(zhǔn)確反映樣品的酶活力大小。酶解時(shí)間對(duì)纖維素降解的影響見圖4，酶濃度為6U·mL^-1，酶解1.5d可使大部分纖維素降解，所得葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.74mg·g^-1。酶解4.5～5.5 d時(shí)葡萄糖為74.60～79.60 mg·g^-1，且趨于穩(wěn)定，因此，可選擇4.5d為最佳酶解反應(yīng)時(shí)間。

3.2.4不同酶液處理對(duì)纖維素降解的影響將纖維素酶A，B，C分別加入到酸預(yù)處理和堿預(yù)處理的丹參藥渣中，降解后葡萄糖的含量見圖5，由圖5可知，堿預(yù)處理.纖維素酶C降解后的效果最佳，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)119.50mg·g^-1，相同濃度纖維素酶C酶解的酸預(yù)處理藥渣次之。

3.3方法學(xué)考察結(jié)果

利用HPLC-PDA方法建立了二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮Ⅱ4個(gè)化合物含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行了穩(wěn)定性、重復(fù)性、及精密度等方法學(xué)考察。其所測(cè)定的結(jié)果見表1，所測(cè)化合物的方法學(xué)考察其RSD均小于2%，回收率在94.63%～102.1%，RSD小于2.3%。以上結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)可以用于樣品中這4個(gè)丹參酮成分的檢測(cè)。

3.4不同預(yù)處理對(duì)丹參酮類成分的提取量的影響

與常規(guī)非酶法處理藥渣相比，丹參酮的提取量在通過酶液降解后，丹參酮Ⅱ。提取量提高可達(dá)82.54%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.451mg·g^-1；丹參酮I提取量提高可達(dá)81.82%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.373mg·g^-1；隱丹參酮提取量提高可達(dá)64.4%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.080mg·g^-1；二氫丹參酮I提取量提高可達(dá)61.3%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)0.601 2 mg·g^-1，見表2。通過比較不同處理方式總丹參酮提取效率可見，通過堿預(yù)處理.纖維素酶C降解后所得總丹參酮提取效率最高，酸預(yù)處理中纖維素酶C降解效果較佳，這與3.2.3項(xiàng)下纖維素酶降解纖維素的結(jié)果相一致。4討論

現(xiàn)代研究表明，丹參酮類成分具有抗氧化、心腦血管藥理作用、抗菌消炎作用以及肝保護(hù)等多種生物活性，尤其在抗腫瘤方面尤為突出，臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病、感染性疾病以及糖尿病等的治療。由于丹參相關(guān)的制劑的使用量逐年增加，丹參酮和高純度丹參酮的需求量每年大幅增加。但技術(shù)力量較為薄弱，工藝較為陳舊，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本高，經(jīng)濟(jì)效益低，環(huán)境污染嚴(yán)重等諸多因素，造成丹參資源的極大浪費(fèi)。

目前，丹參酮類的提取方法主要有非離子表面活性劑輔助提取、超臨界CO₂，萃取法、超順磁性吸附劑提取、超聲提取法、微波提取法、超高壓輔助提取等。上述提取方法均可不同程度的提高丹參酮的提取率，但酶解法可加速有效成分的釋放，還可將提取物中的雜質(zhì)分解去除，也可促進(jìn)某些極性低的脂溶成分轉(zhuǎn)化為易溶于水的糖苷類成分而利于提取，在中藥行業(yè)中的應(yīng)用前景廣闊。

本實(shí)驗(yàn)分析和比較了DNS法測(cè)定3種纖維素酶活力（自制酶液、國產(chǎn)纖維素酶以及SIGMA纖維素酶），結(jié)果顯示，SIGMA纖維素酶酶活力最佳；在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)常規(guī)性的影響酶解反應(yīng)因素，酶濃度和酶解反應(yīng)時(shí)間等因素進(jìn)行了單因素考察，確定了酶解的最適條件。并在此條件下，利用纖維素酶酶解丹參藥渣后提取丹參酮類成分，此方法操作簡(jiǎn)便，適應(yīng)性強(qiáng)。因此，提高丹參酮類成分的提取效率，可考慮將酶提取法與其他方法聯(lián)用，例如采用酸堿預(yù)處理后酶解或酶法提取后再用超聲提取，可大大提升丹參酮類成分的提取效率，獲得純度較高的提取物，且可減少提取過程中熱不穩(wěn)定成分的損失。