基于p38MAPK通路初探大黃黃芩配伍對(duì)內(nèi)毒素血證模型大鼠肝臟炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制

王沛明+陳文+張袆+王平+孟憲麗

[摘要]為了探究大黃黃芩藥對(duì)對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血證模型大鼠肝臟炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制，選取取雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為空白組、模型組、地塞米松組、藥對(duì)高劑量組、藥對(duì)低劑量組，每組10只。各組大鼠給予相應(yīng)藥物進(jìn)行預(yù)防性給藥，連續(xù)給藥7d。末次給藥結(jié)束0.5h后尾靜脈注射LPs（5 mg·kg^-1）造模，后每0.5h測(cè)定一次動(dòng)物肛溫并記錄，于造模后4h處死動(dòng)物，測(cè)定脾臟胸腺系數(shù)；采用ELISA法檢測(cè)肝組織中細(xì)胞因子白介素、腫瘤壞死因子-a（TNF-a）的含量；采用比色法測(cè)定肝組織中一氧化氮（NO）含量；采用westem blot法檢測(cè)肝組織中Toll樣受體蛋白4（Toll樣受體-4），p38MAPK，磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）及一氧化氮合成酶（iN0s）蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空白組大鼠相比，模型組大鼠肝組織中TLR4蛋白表達(dá)、iN0s蛋白表達(dá)、p38磷酸化表達(dá)升高，IL-1，N0，TNF-a含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，藥對(duì)高劑量能顯著降低大鼠肝組織中IL-1，N0，TNF-a的表達(dá)（P<0.05或P<0.01），下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)與p38磷酸化表達(dá)（P<0.05），但對(duì)TLR4蛋白并未出現(xiàn)顯著的回調(diào)作用；藥對(duì)低劑量能顯著降低模型大鼠肝組織中IL-1，N0的表達(dá)（P<0.01），顯著下調(diào)iNOS蛋白表達(dá)（P<0.01），對(duì)p38磷酸化表達(dá)具有一定的下調(diào)趨勢(shì)但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)TLR4蛋白表達(dá)并沒有表現(xiàn)出一定降低作用。大黃黃芩配伍使用可能是通過減少p38蛋白的磷酸化表達(dá)從而阻斷p38MAPK信號(hào)通路，來減少iN0s蛋白表達(dá)和炎性因子IL-1，NO，TNF-a的釋放，從而達(dá)到減緩炎癥反應(yīng)保護(hù)機(jī)體組織的作用。

內(nèi)毒素血癥是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖即內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)引發(fā)的一系列病理生理改變的總稱，許多嚴(yán)重疾病的病理過程中均伴隨著內(nèi)毒素血癥，并成為許多危重癥的重要致死原因。研究表明內(nèi)毒素血癥引起的炎癥反應(yīng)與組織器官嚴(yán)重?fù)p傷與多條炎癥通路的激活有關(guān)，如核因子（nuclear factor，NF）-KB，Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase signal transduction andtranscription activator，JAK-STAT）信號(hào)通路等。其中，p38MAPK信號(hào)通路是一條抗炎干預(yù)炎癥性損傷的“經(jīng)典”途徑。內(nèi)毒素（LPS）進(jìn)入血液循環(huán)后，經(jīng)TLR4受體蛋白識(shí)別將信號(hào)傳人胞漿后激活p38MAPK通路導(dǎo)致p38蛋白磷酸化表達(dá)上升，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子活化，并最終導(dǎo)致iNOS蛋白以及炎癥因子如TNF-a，IL-1，NO等的大量表達(dá)，造成機(jī)體損傷。而肝臟作為人體中的一個(gè)重要的代謝器官，在身體內(nèi)起著去氧化、排毒等作用，在內(nèi)毒素血癥中肝臟通過血液循環(huán)代謝清除癥產(chǎn)物對(duì)于炎癥的緩解以及機(jī)體的保護(hù)起著至關(guān)重要的作用。然而肝臟作為代謝的主要場(chǎng)所也常常容易受到炎癥介質(zhì)的侵襲造成肝損傷，而肝臟的損傷又進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體代謝能力下降，最終導(dǎo)致炎癥損傷進(jìn)一步加重。

大黃.黃芩作為中藥經(jīng)典藥對(duì)，古方多有記載，兩者常常通過配伍使用從而達(dá)到增效作用來治療熱毒內(nèi)盛的熱毒證，現(xiàn)有資料已表明大黃、黃芩單味藥對(duì)炎癥有良好的緩解和治療作用，然而對(duì)于傳統(tǒng)中醫(yī)中二者配伍使用的研究卻鮮有出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立內(nèi)毒素大鼠模型，選取機(jī)體中重要的代謝器官肝臟作為主要研究對(duì)象，基于p38MAPK通路初步探究大黃黃芩配伍對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制，并通過對(duì)比目前研究現(xiàn)狀揭示其與單味藥使用作用機(jī)制與作用強(qiáng)度可能的差別。

1材料

1.1藥物制備

大黃與黃芩藥材購(gòu)自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴(yán)鑄云教授鑒定分別為藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensjs Georgi.的干燥根。藥對(duì)水提物制備：大黃黃芩藥對(duì)配伍比例依據(jù)經(jīng)典方劑三黃瀉心湯，大黃黃芩配比為2：1。準(zhǔn)確稱取大黃30g、黃芩15g，加水約300mL，浸泡0.5h，用武火煎至沸騰后改用文火煎40min。傾出藥液，加水約240mL再煎25min。合并藥液濃縮至100mL，得0.45（生藥）g·mL^-1，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，于?dòng)物給藥前以蒸餾水倍比稀釋成1：0.5高、低2個(gè)不同劑量，即分別含生藥0.45，0.225 g·mL^-1。陽(yáng)性藥物：地塞米松片用蒸餾水稀釋成0.75 g·L^-1。

1.2動(dòng)物

成年雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重（200±10）g，由四川成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2013-24。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟腑病癥實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK（川）2012-179。

1.3試劑

LPS，Ecdi 055：B5（Sigma公司）；IL-1ELISA試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號(hào)141202）；TNF-a ELISA試劑盒（上海依科賽科技股份有限公司，批號(hào)141202）；NO試劑盒（南京建成）；BCA試劑盒（美國(guó)賽默飛科技有限公司，批號(hào)23227）；兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體，兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體，兔抗大鼠iNOS多克隆抗體（abcam公司）；兔抗大鼠TLR4多克隆抗體（CST公司）；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體（SAB公司）；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（北京中衫金橋公司）。

1.4儀器

PowerPAC200電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Trans-Blot轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Pharos FX熒光凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Varioskan全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）。

2方法

2.1動(dòng)物分組及給藥

成年雄性SD大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，依照體重與平均體溫將大鼠均衡分為5組，每組10只，分別設(shè)為空白組、模型組、地塞米松組、藥對(duì)高劑量組（相當(dāng)于生藥4.5 g·kg^-1）、藥對(duì)低劑量組（相當(dāng)于生藥2.25 g·kg^-1）。各組動(dòng)物經(jīng)灌胃分別給予相應(yīng)藥物，每日早晚8：00各給藥1次，給藥體積為5 mg·kg^-1，連續(xù)給藥7d，空白組和模型組給予等體積的純水。

2.2模型制備及樣本采集

實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水8h，末次給藥結(jié)束后，除空白組外各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射LPS（5mg·kg^-1）造模，空白組使用等體積的生理鹽水進(jìn)行注射，全部操作均按無菌無熱原要求控制。大鼠注射LPS4h后，使用20%烏拉坦（1.0g·kg^-1）麻醉，剖取大鼠肝臟、胸腺、脾臟，并迅速進(jìn)行稱重，采集組織迅速置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)至一80℃保存，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)相關(guān)測(cè)試（課題組前期分別選取了2，4，6，8，10 h對(duì)內(nèi)毒素血證模型大鼠肝組織炎性因子與TLR4-MAPK信號(hào)通路蛋白的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相關(guān)炎癥指標(biāo)與蛋白表達(dá)在LPS刺激造模后4 h表達(dá)升高顯著，因此本次選擇造模4 h后取樣檢測(cè)進(jìn)行研究）。

2.3指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1大鼠體溫變化測(cè)定

于注射LPS造模結(jié)束后0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h分別測(cè)定動(dòng)物肛溫，分析各組動(dòng)物的體溫變化情況。

2.3.2脾、胸腺組織臟器系數(shù)的測(cè)定

稱量并計(jì)算各組動(dòng)物脾臟及胸腺的臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體重（100g）。

2.3.3肝組織IL-1，TNF-a，NO細(xì)胞因子的測(cè)定

取肝組織用生理鹽水制成10%勻漿，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）按照試劑盒上的要求測(cè)定肝組織中IL-1，TNF-a細(xì)胞因子的含量；采用比色法按照試劑盒上的要求測(cè)定肝組織中NO細(xì)胞因子的含量。

2.3.4肝臟TLR4，iNOS蛋白表達(dá)含量和p38總蛋白及磷酸化表達(dá)的測(cè)定

從-80℃冰箱中取出50mg肝組織，用PBS反復(fù)沖洗，棄去PBS沖洗液，向肝組織中加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟（phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF）的總蛋白裂液，于冰上進(jìn)行組織勻漿，將勻漿液放入4℃離心機(jī)，15000r·min^-1離心10min，取上清液，少量用于BCA法測(cè)定蛋白濃度，其余按1：1與蛋白上樣緩沖液混勻，在沸水中煮10min進(jìn)行蛋白變性，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)BCA測(cè)定總蛋白結(jié)果對(duì)樣本取樣（按60μg的總蛋白取樣），使用10%聚丙烯進(jìn)行凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%TBST室溫封閉2 h后，加入1：1 000稀釋的TLR4，p38MAPK，p-p38MAPK，iNOS抗體，4℃搖床過夜，洗膜后加入1：1萬稀釋的二抗，室溫孵育2 h，最終用凝膠成像儀進(jìn)行檢測(cè)。Quantity One軟件對(duì)檢測(cè)圖像進(jìn)行分析，分析結(jié)束后使用0.1%NaOH漂洗，依照目的蛋白檢測(cè)方法對(duì)內(nèi)參（GAPDH）進(jìn)行檢測(cè)。以目的蛋白的吸光度（A）與對(duì)應(yīng)GAPDH的A表示該樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇LSD（方差齊）或Tamhane's（方差不齊）。

3結(jié)果

3.1造模后大鼠體溫變化

LPS經(jīng)尾靜脈注射人大鼠體內(nèi)后大鼠體溫應(yīng)激性升高，0.5～1.5h體溫降低，1.5～4h體溫不斷升高，體溫變化與文獻(xiàn)表述保持一致。對(duì)比模型組，藥對(duì)高、低劑量組能夠一定程度的降低模型大鼠的體溫1.5h后升高的現(xiàn)象，見圖1。

3.2大鼠臟器系數(shù)的變化

對(duì)比空白組，模型組與藥對(duì)高、低劑量組大鼠脾臟系數(shù)與胸腺系數(shù)均未出現(xiàn)明顯變化，而地塞米松組大鼠脾臟系數(shù)與胸腺系數(shù)均顯著降低（P<0.05），見表1。

3.3肝組織中炎癥因子表達(dá)水平比較

對(duì)比空白組，模型組大鼠肝組織中IL-1，NO，TNF-a含量顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，藥對(duì)高劑量組大鼠肝組織中IL-1，TNF-a，NO顯著降低（P<0.05）；對(duì)比模型組，藥對(duì)低劑量組大鼠肝組織IL-1，N0顯著降低（P<0.05），TNF-a含量具有一定降低趨勢(shì)，但無顯著性差異，見表2。

3.4大鼠肝組織p38MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

對(duì)比空白組，模型組大鼠肝組織p38蛋白磷酸化表達(dá)顯著升高，iNOS與TLR4蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）；對(duì)比模型組，藥對(duì)高劑量組大鼠肝組織iNOS蛋白的表達(dá)與p38蛋白的磷酸顯著降低（P<0.05），但TLR4受體蛋白表達(dá)僅表現(xiàn)出了一定的抑制趨勢(shì)；對(duì)比模型組，藥對(duì)低劑量組大鼠肝組織中iNOS蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），p38蛋白磷酸化表達(dá)表現(xiàn)出一定降低趨勢(shì)，而TLR4受體蛋白的表達(dá)未表現(xiàn)降低的趨勢(shì)，見圖2～4。

4討論

內(nèi)毒素血癥是由于大量細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)引起了體內(nèi)一系列免疫反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)的一系列病理生理改變，目前對(duì)于內(nèi)毒素血癥的研究隨著免疫應(yīng)答通路研究的進(jìn)展而不斷的深入，逐漸從簡(jiǎn)單的癥狀研究轉(zhuǎn)入對(duì)各種細(xì)胞通路動(dòng)態(tài)變化過程的研究，其基本進(jìn)程大致分成4個(gè)部分，即胞膜受體的識(shí)別、胞漿信號(hào)的傳遞、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子翻譯以及最后炎癥因子的釋放。TLR4蛋白是細(xì)胞表面一類重要的受體蛋白，幾乎分布于所有的細(xì)胞系中，它可以對(duì)不同病原相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合并引發(fā)下游一系列信號(hào)傳導(dǎo)，是病原體的重要傳感器，其參與了細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥及其他多種疾病發(fā)展密切相關(guān)。LPS則是TLR4的最重要的配體，LPS與TLR4相結(jié)合后通過系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路并向下傳導(dǎo)。研究表明黃芩中的有效成分黃芩苷、漢黃芩苷，大黃中的有效成分大黃素等均能降低TLR4蛋白的表達(dá)，從而降低炎癥介質(zhì)的釋放。TLR4被激活后通過髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）依賴反應(yīng)通路，激活人腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factorreceptor-associated factor 6，TRAF-6），并與接頭蛋白TAKl激活蛋白因子（TAKl.binding proteinl TABl）相結(jié)合，最終以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活性激酶1tivated kinase 1，TAK-1）為紐帶激活胞漿內(nèi)的p38MAPK通路?，F(xiàn)代研究表明p38MAPK通路是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，能夠促進(jìn)白細(xì)胞的聚集和活化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性和細(xì)胞因子的合成，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控起著關(guān)鍵性的作用。在受到TLR4通路誘導(dǎo)激活后，通過某種中間環(huán)節(jié)使MAPKKK激活，轉(zhuǎn)而激活MAPKK；MAP.KK激活后再通過雙位點(diǎn)磷酸化調(diào)控p38MAPK的活性導(dǎo)致p38蛋白發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)變?yōu)閜-p38蛋白進(jìn)而發(fā)生核轉(zhuǎn)位，并調(diào)控下游蛋白激酶，激活炎癥因子例如IL-1，TNF-a等的釋放，從而造成機(jī)體組織損傷。因此通過阻斷p38MAPK通路關(guān)鍵蛋白的激活與表達(dá)，進(jìn)而阻斷p38MAPK通路信號(hào)的傳導(dǎo)，是減少炎癥介質(zhì)釋放，治療內(nèi)毒素血癥的重要途徑之一。

古代并無內(nèi)毒素血癥的病名，但當(dāng)代研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)熱毒證證型與內(nèi)毒素血癥初期癥狀相似。因此臨床常使用具有瀉火通腑作用的大黃與瀉肺熱解毒的黃芩這2個(gè)經(jīng)典中藥藥對(duì)來配伍，用于內(nèi)毒素血癥初期的治療。研究表明大黃、黃芩單味藥物對(duì)于內(nèi)毒素血癥引起的炎癥均有良好的治療作用，同時(shí)數(shù)據(jù)指出當(dāng)大黃黃芩配伍使用后其抗炎效果往往優(yōu)于單味藥物的使用。基于此課題組進(jìn)一步深入探討大黃黃芩配伍使用對(duì)于內(nèi)毒素血癥引起的肝臟炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制。課題組首先通過造模對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)模型大鼠肝組織TLR4，p38MAPK相關(guān)信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，見圖5～6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)主要集中在造模4h后顯著升高，因此確定了以4h為時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)研究的主要時(shí)間點(diǎn)。同時(shí)課題組前期對(duì)單味藥物進(jìn)行了相同分子水平的探究，結(jié)果顯示，大黃黃芩單味藥物對(duì)下游炎癥因子IL-1，TNF-a，NO的釋放均有一定的抑制趨勢(shì)，其機(jī)制可能與減少調(diào)p38MAPK通路中關(guān)鍵蛋白p38蛋白磷酸化減少膜上受體蛋白TLR4表達(dá)有關(guān)，然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示大黃黃芩配伍后對(duì)TLR4受體蛋白表達(dá)并未出現(xiàn)顯著的抑制作用，這與單味藥物的作用機(jī)制表現(xiàn)出了一定的差別。

綜上所述，借助LPS誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)毒素血證模型，并基于p38MAPK蛋白通路，筆者闡明，大黃黃芩配伍使用能夠降低模型大鼠肝組織中炎癥介質(zhì)IL-6，IL-1，TNF-a的釋放，以及iNOS蛋白的表達(dá)，并且與p38磷酸化的抑制趨勢(shì)相同，但與受體蛋白TLR4的抑制趨勢(shì)并沒有顯著的相關(guān)性。提示大黃黃芩配伍使用對(duì)內(nèi)毒素血證肝臟炎癥的治療機(jī)制可能是通過阻斷胞漿內(nèi)的p38MAPK通路來實(shí)現(xiàn)的，這與課題組前期單味藥物的研究有所不同，配伍使用并不能對(duì)細(xì)胞膜上的受體蛋白TLR4蛋白起到一定的抑制作用，原因筆者認(rèn)為其一可能與劑量有關(guān)，中藥水提物中相關(guān)成分不能達(dá)到單一成分用藥的濃度水平；其二可能與配伍后成分之間的相互反應(yīng)與相互作用有關(guān)，導(dǎo)致相關(guān)成分溶出率與化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)。然而關(guān)于大黃黃芩配伍使用后相對(duì)于單味藥使用增效的機(jī)制與原因并沒有得出，后續(xù)課題組將繼續(xù)從單味藥物與藥對(duì)進(jìn)行對(duì)比研究，觀察相關(guān)指標(biāo)變化，并結(jié)合前期課題組對(duì)單味藥相關(guān)指標(biāo)的研究，進(jìn)一步探究大黃黃芩配伍的增效機(jī)制。與此同時(shí)通過對(duì)比主要免疫器官的臟器系數(shù)變化發(fā)現(xiàn)，大黃黃芩藥對(duì)比西藥在長(zhǎng)期使用后毒性較小，對(duì)臟器損傷較輕，體現(xiàn)出中藥在使用中低毒的特性。