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    基于H—NMR代謝組學(xué)技術(shù)的青翹抗炎活性部位篩選及作用機制研究

    2017-05-17 17:13岳永花何盼孫迎娜白關(guān)亞郝旭亮
    中國中藥雜志 2016年18期
    關(guān)鍵詞:急性肺損傷代謝組學(xué)抗炎

    岳永花+何盼+孫迎娜+白關(guān)亞+郝旭亮+倪艷

    [摘要]為篩選青翹抗炎的活性部位,明確作用機制,該研究給予雄性SD大鼠青翹水煎液、乙酸乙酯、正丁醇和剩余水層各部位提取物,連續(xù)15d,復(fù)制急性肺損傷炎癥模型,觀察肺組織切片結(jié)構(gòu),測試肺泡灌洗液的IL-6,TNF-a,IL-1,IL-10的水平,收集血清,采用H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。結(jié)果顯示青翹乙酸乙酯部位抗急性肺損傷炎癥活性較好,能夠抑制炎癥因子IL-6,TNF-a,IL-1的釋放,明顯降低血清中肌酸、丁酸、琥珀酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺的含量,升高GPC的含量。該研究從體內(nèi)代謝的角度進一步證明了乙酸乙酯部位是青翹抗炎的主要活性部位,主要通過調(diào)節(jié)肌酸代謝、膽堿代謝、支鏈氨基酸代謝以及三羧酸循環(huán)等通路發(fā)揮抗炎作用,可為青翹抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)。

    [關(guān)鍵詞]青翹;急性肺損傷;抗炎;活性部位;代謝組學(xué)

    連翹系木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實,具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱之功效,大量研究證明連翹具有明顯的抗炎作用,按照采收時間的不同,通常將連翹分為青翹和老翹,2015年版《中國藥典》規(guī)定,青翹為秋季果實初熟尚帶綠色時采收,除去雜質(zhì),蒸熟,曬干而成;老翹則為果實熟透時采收,曬干,除去雜質(zhì)而成。本課題組前期對青翹和老翹的藥理作用進行了系統(tǒng)比較,發(fā)現(xiàn)青翹的抗炎作用優(yōu)于老翹。

    炎癥模型根據(jù)發(fā)病原因可分為感染性炎癥、非特異性炎癥(包括小鼠耳腫脹、大鼠足跖腫脹、肉芽腫模型等)及變態(tài)反應(yīng)性炎癥。內(nèi)毒素(即脂多糖LPS)通過吸入方式進入機體后誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)和細胞因子的產(chǎn)生與釋放,從而損傷肺泡上皮細胞及肺毛細血管內(nèi)皮細胞,導(dǎo)致肺泡.毛細血管屏障通透性增加,最終造成感染后的急性肺損傷模型。曾有研究基于LPS誘導(dǎo)的人呼吸道上皮細胞炎癥模型對連翹提取物抗炎活性進行了研究,結(jié)果表明90%連翹酯苷A為連翹提取物抗炎的主要活性部位,活性成分為連翹酯苷A,從體外細胞實驗證明了連翹對呼吸系統(tǒng)疾病的抗炎作用,但其在體內(nèi)的抗炎活性部位及其作用機制尚無相關(guān)研究。

    代謝組學(xué)是利用現(xiàn)代分析技術(shù)(如LC-MS,GC-MS,NMR)定量測定生物體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,考察生物體在不同狀態(tài)(生理和病理)下代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化,能反映機體調(diào)控過程的終點,從而表征特定環(huán)境下生物體的整體功能狀態(tài),具有整體性、動態(tài)性和系統(tǒng)性的特點,目前已廣泛應(yīng)用于中藥活性部位、活性成分的篩選及藥物作用機制等研究。本研究通過復(fù)制急性肺損傷炎癥模型,從病理形態(tài)結(jié)構(gòu)、炎癥因子等傳統(tǒng)藥效學(xué)評價結(jié)果,結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)對青翹抗炎的活性部位進行篩選,并闡明作用機制,為連翹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

    1材料

    1.1儀器

    BioTek Synergy H1全功能微孔板檢測儀(美國BioTek公司);JWC-201D超聲霧化器(鞍山市同信醫(yī)用儀器廠);KDC-2046低速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);Bruker 600 MHzAvanceⅢNMR Spectrometer(德國Bruker公司,600M核磁儀,600.13 MHz質(zhì)子頻率);SIGMA 1-14高速離心機;石蠟包埋機(Histocentre 3,英國Shan.don);石蠟切片機(Finesse 325,英國Shandon);全自動組織脫水機(Excelsior,英國Shandon);熒光顯微成像系統(tǒng)(BX53,日本Olympus公司)。

    1.2藥品與試劑

    內(nèi)毒素(solarbio,批號818E035);ELISA(IL-6,TNF-a,IL-1,IL-10)試劑盒(武漢博士德生物,批號EK0393);正丁醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙酸乙酯(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);石油醚30~60℃(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80,天津市申泰化學(xué)試劑有限公司);重水(D:O,Sigma-aldrich,USA)。青翹飲片(山西產(chǎn),批號20140703)購自亳州成源中藥飲片有限公司,經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑所倪艷教授鑒定為青翹果實。

    1.3實驗動物

    健康SD大鼠,雄性,體重(200±20)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號SCXK(京)201343005,合格證號11804800001547。

    1.4藥物制備

    取青翹飲片1kg,加10倍量水浸泡1h,煎煮1h,濾出藥液,藥渣加8倍量水煎煮30min,重復(fù)1次,合并3次藥液,并減壓濃縮至1.0 g·mL-1。將濃縮至1.0g·mL-1的青翹水煎液按1:1依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次,分出上層,合并各部位,回收溶劑,減壓干燥,得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及剩余水層的浸膏。由于石油醚萃取部位的浸膏量較小,因此未進行后續(xù)實驗。將青翹水煎液和各部位提取物,按生藥量4 g·kg-1。(臨床劑量的16倍)進行換算,加0.5%吐溫80制成混懸液。

    2方法

    2.1模型復(fù)制及給藥方法

    健康SD大鼠60只,隨機分為空白組、模型組、青翹水煎液組、乙酸乙酯組、正丁醇組和水層組,每組10只。青翹水煎液組、乙酸乙酯組、正丁醇組和水層組分別灌服生藥量4 g·kg-1的相應(yīng)溶液,空白組和模型組大鼠灌服等量的生理鹽水,連續(xù)15d。末次給藥后,除空白組外,每組大鼠分別置于20mL20%內(nèi)毒素溶液經(jīng)超聲波霧化器霧化的內(nèi)毒素氣體中30 mint。

    2.2樣本收集及指標檢測

    造模后4 h,20%烏拉坦麻醉后心臟取血,放置1 h,3 500 r·min。離心20min,取上清液,并分裝,于一80℃保存,備用。結(jié)扎右肺中葉后于頸部正中切開暴露氣管,并將氣管上端結(jié)扎,插入磨圓的注射器針頭,用5 mL生理鹽水灌洗,通過氣管插管慢慢注入氣管內(nèi),反復(fù)抽吸幾次,將洗液抽出,重復(fù)3次,最后得到2.5 mL洗液。將洗液放置1h后,3500r·min-1離心20min,收集上清液。用ELISA試劑盒測定肺洗液中IL-6,TNF-a,IL-1和IL-10的含量,結(jié)果采用SPSS16.0軟件進行t檢驗,以x±s表示。取結(jié)扎的右肺中葉部位,固定于10%甲醛溶液中,石蠟包埋,HE染色,做病理學(xué)檢查。

    2.3代謝組學(xué)分析

    2.3.1樣本處理血清樣品解凍后,吸取450μL于1.5 mL EP管中,加入350μL D20,渦旋30s,離心(4℃,13 000 r·min-1)20 min,取600μL上清液轉(zhuǎn)移至核磁管(直徑5 mm)中,待測。

    2.3.2H-NMR測試條件

    樣品在Bruker 600MHz AVANCEⅢNMR儀(Bruker 5 mm BBO探頭,600.13 MHz,298 K)測定。采用cpmgprld脈沖序列以衰減脂蛋白和蛋白質(zhì)的寬單峰;掃描次數(shù)為64,譜寬為12019.2 Hz,圖譜大小65 536數(shù)據(jù)點,脈沖時間14μs,傅里葉變換LB=0.3 Hz,弛豫時間1.0s。

    2.3.3H-NMR圖譜處理采用MestReNova(vet.sion 6.0.1,Mestrelab Research,Santiago de Compost-ella,Spain)核磁圖譜處理軟件對所有H-NMR圖譜進行相位、基線調(diào)整,以肌酸(6 3.04)為標準對譜圖進行化學(xué)位移的校正,對6 0.60~5.60區(qū)域的譜圖進行6 0.01等寬度分割,水峰6 4.60~5.16區(qū)域以及麻醉劑信號4.13~4.18,1.31~1.33區(qū)域切除,其余區(qū)段積分。

    2.3.4數(shù)據(jù)處理采用SIMCA-P 11.0(Umetrics,瑞典)軟件對H-NMR采集處理的積分數(shù)據(jù)中心化和規(guī)格化后,進行主成分分析(principal componentanalysis,PCA),結(jié)果以PCA score plot表示,其中1個點代表1個樣本(即1個代謝組),進一步用偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminantanalysis,PLS-DA)優(yōu)化組間差異,以相應(yīng)的VIP(var.iable importance in projection)值來尋找差異成分,VIP越大,表明該積分區(qū)間對應(yīng)的化合物對分組貢獻越大。采用SPSS 16.0軟件中one-way ANOVA對差異代謝物進行顯著性檢驗。

    3結(jié)果

    3.1病理學(xué)結(jié)果

    空白組肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔清晰,腔內(nèi)無滲出液體或炎癥細胞,基本正常;模型組肺泡組織可見增寬,間隔內(nèi)炎細胞浸潤,間質(zhì)中至重度充血,灶性肺泡內(nèi)充滿大量的紅細胞,肺泡中至重度擴張;乙酸乙酯組間質(zhì)輕度充血,輕度炎細胞浸潤,肺泡輕至中度擴張;正丁醇組和水層組肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)充滿紅細胞,間質(zhì)炎細胞浸潤,擴張嚴重的肺泡相互融合形成大的肺泡;水煎液組間質(zhì)輕度增寬、充血,炎細胞輕度浸潤。因此,與空白組相比,青翹乙酸乙酯提取物組肺組織損傷最小,其次為水煎液組,見圖1。

    3.2生化指標檢測

    與空白組相比,模型組肺洗液中IL-6,TNF-a,IL-1的含量顯著升高(P<0.01),表明模型復(fù)制成功;與模型組相比,乙酸乙酯組IL-6,TNF-a,IL-1的水平均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);正丁醇組只有TNF-a的含量明顯低于模型組;水煎液組TNF-a,IL-1的含量明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);剩余水層各指標與模型組相比無顯著性變化。各組之間IL-10的含量無明顯差異,結(jié)果見表1,表明青翹乙酸乙酯組可以顯著抑制炎癥因子的釋放,抗炎作用明顯。

    3.3H-NMR代謝組學(xué)分析

    3.3.1大鼠血清H-NMR圖譜歸屬

    給予青翹水煎液、乙酸乙酯、正丁醇提取物后大鼠血清核磁圖譜見圖2,根據(jù)化學(xué)位移、峰形、耦合常數(shù),結(jié)合文獻[12.13]以及數(shù)據(jù)庫the human metabolome database(HMDB,http://www.hmdb.ca/),biological magneticresonance data bank(BMRB,http://www.bmrb.wisc.edu/)對圖譜進行指認,共鑒定24個化合物,包含氨基酸、有機酸、碳水化合物等,具體化學(xué)位移歸屬見表2。

    3.3.2多元統(tǒng)計分析直觀分析圖譜,較難發(fā)現(xiàn)各組間差異,因此借助多元統(tǒng)計分析,全面對比圖譜。對空白組、模型組、青翹水煎液組、乙酸乙酯部位和正丁醇部位大鼠血清核磁圖譜進行PLS-DA分析,評價PLS-DA模型常用排列實驗判定有效性,2條回歸線斜率越大,左端任何一次隨機排列產(chǎn)生的小于右端,且最右端的2個值差距較小,證明模型有效。5組樣本整體分布得分圖和模型驗證見圖3,表明吸入內(nèi)毒素和給予青翹提取物后,大鼠血清內(nèi)源性代謝物發(fā)生了變化;空白組、水煎液組、乙酸乙酯部位與正丁醇組、模型組基本沿t軸分開,水煎液和乙酸乙酯部位對吸入內(nèi)毒素的炎癥模型大鼠有向空白組調(diào)節(jié)的趨勢,且乙酸乙酯組更接近空白組,而正丁醇部位作用不明顯,表明青翹乙酸乙酯部位的抗炎活性最佳,可能是該部位有效富集了青翹的抗炎活性成分。

    模型組分別與空白組、各給藥組進行PLS-DA分析,結(jié)果見圖4??瞻捉M與模型組能明顯分開且模型驗證成立,表明吸人內(nèi)毒素的急性肺損傷炎癥模型復(fù)制成功。青翹水煎液組、乙酸乙酯組與模型組對比,均能明顯分開且模型有效、可靠;而正丁醇組與模型組PLS-DA模型驗證不成立,表明青翹水煎液組和乙酸乙酯組可以調(diào)節(jié)炎癥模型大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,發(fā)揮了抗炎作用。

    模型組血清與空白組相比,以VIP值大于1確定了13個差異代謝物,肌酸、丁酸、琥珀酸、賴氨酸、纈氨酸、葡萄糖、異亮氨酸、谷氨酰胺和TMA0含量升高,而丙氨酸、丙酮酸、GPC和PC含量降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。差異代謝物在各組中的含量分布見圖5,與模型組相比,青翹水煎液組顯著調(diào)節(jié)6個代謝物,肌酸、丁酸、琥珀酸、葡萄糖和TMAO的含量降低,GPC含量升高(P<0.05);乙酸乙酯組顯著調(diào)節(jié)B個代謝物,肌酸、丁酸、琥珀酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和谷氨酰胺的含量降低,GPC含量升高(P<0.05);正丁醇組對差異代謝物的調(diào)節(jié)不顯著;各給藥組對丙氨酸、丙酮酸和PC含量的調(diào)節(jié)均無顯著性變化;進一步證明了青翹乙酸乙酯部位具有明顯的抗炎作用。

    4討論

    國內(nèi)外研究表明內(nèi)毒素致急性肺損傷模型的特點為:血液、肺支氣管灌洗液中炎癥因子水平升高及相關(guān)酶活性發(fā)生變化;肺血管壁通透性升高;肺組織病理切片上會有輕度肺水腫的現(xiàn)象。LPS進入血液與相應(yīng)受體結(jié)合激活單核.巨噬細胞等免疫細胞,誘發(fā)機體釋放各種細胞因子,這些細胞因子可分為:①介導(dǎo)組織損傷的促炎細胞因子,如TNF-a,IL.6,IL-1等;②抗炎細胞因子,如IL-4,IL-10等。本研究主要考察了肺泡灌洗液中TNF-a,IL-6,IL-1和IL-10的水平,結(jié)果表明乙酸乙酯部位能夠明顯降低IL-6,TNF-a和IL-1/~的水平,水煎液組可以明顯降低TNF-a和IL-1,正丁醇部位僅能使TNF-a的水平明顯降低,剩余水層對各指標的調(diào)節(jié)不明顯。各組之間IL-10的含量無明顯變化,模型組IL-6,TNF-a,IL-1和IL-10的含量高于空白組,說明內(nèi)毒素導(dǎo)致急性肺損傷炎癥過程中促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)同時存在,青翹發(fā)揮抗炎作用主要是通過抑制促炎癥細胞因子的釋放。

    本研究進一步對空白組、模型組、青翹水煎液組、乙酸乙酯組和正丁醇組大鼠血清進行核磁共振代謝組學(xué)分析,共指認24個代謝物,通過模式識別尋找到13個差異代謝物。為了明確青翹減輕急性肺損傷炎癥所涉及的代謝通路,本研究參考KEGG數(shù)據(jù)庫對發(fā)現(xiàn)的差異代謝物進行生物學(xué)意義闡釋。

    肌酸作為一種營養(yǎng)增補劑,能輔助為肌肉和神經(jīng)供能,是由甘氨酸、精氨酸和甲硫氨酸合成,可以經(jīng)肝臟和腎臟自行合成,也可以從食物中攝取。有研究表明補充肌酸可以減輕慢性阻塞性肺病和囊性纖維化,但其卻能明顯加重過敏性肺病炎癥。本實驗中吸入內(nèi)毒素炎癥模型組肌酸含量較高,而給藥后含量降低,表明青翹可以抑制由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的過敏炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮減輕肺損傷炎癥作用。

    甘油磷酸膽堿(GPC)是機體內(nèi)磷脂代謝的產(chǎn)物之一,也是重要的神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿的生物合成前體。GPC合成磷脂酰膽堿,后者為細胞膜的重要組成部分;神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿組成膽堿能抗炎通路(CAP),該通路激活后可以抑制LPS誘導(dǎo)的NF.KB信號途徑活化,從而使炎癥因子表達下降。本研究水煎液組和乙酸乙酯組的GPC含量高于模型組,提示青翹一方面能夠保護肺泡細胞膜的結(jié)構(gòu),另一方面可以促進乙酰膽堿的釋放,激活CAP,抑制炎癥反應(yīng)。

    纈氨酸、異亮氨酸為9種必需氨基酸中2種,屬于支鏈氨基酸,二者作為生糖氨基酸,通過轉(zhuǎn)氨基作用生成琥珀酰輔酶A,后者為三羧酸循環(huán)(TCA)中很重要的一個酶,其在琥珀酸硫激酶的作用下生成琥珀酸。Nature雜志上已有研究報道,LPS增加了TCA循環(huán)中琥珀酸的水平,琥珀酸是先天免疫信號的代謝物,在炎癥發(fā)生時可以通過轉(zhuǎn)錄因子HIF-1提高IL-1的產(chǎn)量。本實驗中模型組纈氨酸、異亮氨酸含量較高,引起葡萄糖和琥珀酸水平也相對較高。青翹水煎液和乙酸乙酯提取物能顯著降低琥珀酸含量,使IL-1的表達減少,從而抑制炎癥發(fā)生。

    谷氨酰胺體內(nèi)脫氨生成谷氨酸,后者在谷氨酸脫氫酶的作用下生成酮戊二酸,進入三羧酸循環(huán),生成ATP,保證機體能量供給。谷氨酰胺已被報道可以抑制NF.KB活化,衰減炎癥細胞因子的釋放。本研究中谷氨酰胺含量給藥組低于模型組,可能是由于給藥組能量代謝高于模型組,使得其含量降低,具體原因還有待于進一步分析。

    氧化三甲胺(TMAO)的變化反映腸道菌群的紊亂,已有研究表明肺是一個重要的免疫器官,若肺部的炎性損傷未能及時控制,便可成為炎性介質(zhì)的發(fā)源地,加重全身性炎癥反應(yīng)。腸道菌群紊亂提示肺部炎癥連帶機體其他不良反應(yīng)的發(fā)生,青翹水煎液組的抗炎作用可以抑制腸道菌群紊亂。

    青翹主要通過調(diào)節(jié)肌酸、甘油磷酸膽堿、琥珀酸和氧化三甲胺4個主要的生物標志物來發(fā)揮抗炎作用,其余代謝物參與的通路有待進一步分析。水煎液組可以顯著調(diào)節(jié)6個血清內(nèi)源性代謝物,參與的代謝通路有肌酸代謝、膽堿代謝、三羧酸循環(huán)以及腸道菌群代謝,而乙酸乙酯部位共調(diào)節(jié)8個,參與的代謝通路有肌酸代謝、膽堿代謝、支鏈氨基酸代謝以及三羧酸循環(huán),二者調(diào)節(jié)的代謝物部分不同,說明作用靶點存在差異。本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)從機體內(nèi)源性代謝物整體變化的角度進一步證明了乙酸乙酯部位是青翹抗炎的主要活性部位,并闡明了相應(yīng)的作用機制。

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