親水作用色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定參附注射液中的14種有機(jī)酸

劉瑤+張娜+史社坡+宋青青+李軍+宋月林+屠鵬飛

[摘要]有機(jī)酸廣泛分布在植物及相關(guān)產(chǎn)品中，其參與多種代謝途徑（如三羧酸循環(huán)），并表現(xiàn)出多種藥理活性。參附注射液作為廣泛使用的中藥注射劑，不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道。因而，應(yīng)深入闡明參附注射液的化學(xué)組成，并制定嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而保障其臨床使用安全有效。參附注射液由紅參及黑順片經(jīng)現(xiàn)代工藝提取制備而成，有機(jī)酸為其主要成分類別之一。該研究通過建立HTTJTC-LC-MS，同時(shí)測(cè)定參附注射液中肉桂酸、阿魏酸、4-羥基苯甲酸、乳酸、己二酸、延胡索酸、咖啡酸、琥珀酸、馬來酸、丙二酸、蘋果酸、莽草酸、酒石酸和金雞納酸等14種有機(jī)酸成分的含量。14種有機(jī)酸類成分在HTTJTC色譜柱上均獲得較好的保留和分離。除肉桂酸（231μg·L^-1）、乳酸（113μg·L^-1）和丙二酸（32.5μg·L^-1）外，其余11個(gè)化合物的定量限均小于10μg·L^-1。定量結(jié)果表明，蘋果酸、丙二酸、奎尼酸、乳酸和肉桂酸在參附注射液中含量較高（>1.89 mg·L^-1），而10批樣品中均未檢測(cè)到咖啡酸和己二酸。該方法適用于參附等中藥注射液中多種有機(jī)酸含量的同時(shí)測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]有機(jī)酸；參附注射液；多成分含量測(cè)定；親水作用色譜法；質(zhì)譜

參附注射液由紅參和黑順片經(jīng)現(xiàn)代工藝提取制備而成，具回陽救逆、益氣固脫之功效，為臨床常用中藥注射劑。主要用于陽氣暴脫的厥脫癥（感染性、失血性、失液性休克等）及陽虛（氣虛）所致的驚悸、怔忡、喘咳、胃疼、泄瀉、痹癥等作為廣泛使用的中藥注射劑。參附注射液的不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道。因此，應(yīng)深入闡明參附注射液的化學(xué)組成，并制定嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。有機(jī)酸作為參附注射液的主要化學(xué)成分類別之一，在其藥效作用及不良反應(yīng)中均發(fā)揮了重要作用。

有機(jī)酸廣泛分布于植物的根、葉、果實(shí)等部位。常見的植物有機(jī)酸，如脂肪族的酒石酸、草酸、蘋果酸、枸椽酸、抗壞血酸（維生素C）等和芳香族的水楊酸、咖啡酸等。有機(jī)酸常表現(xiàn)出抑菌、消炎、抗病毒、抗突變、抗癌、增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈血流量、降低食糜的pH、增加胰液分泌、改變腸道微環(huán)境等藥理活性。近年來，特別是在短鏈脂肪酸類化合物（SCFA）被認(rèn)定為多種腸道及相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物（biomark-ers）后，有機(jī)酸的定性、定量分析受到了越來越多的關(guān)注。除少數(shù)芳香族有機(jī)酸外，有機(jī)酸類化合物僅在紫外檢測(cè)范圍的末端具有較弱的吸收。并且，該類化合物常表現(xiàn)出較強(qiáng)的極性，甚至是離子態(tài)，使得在常見的RP-C₁₈色譜柱上很難實(shí)現(xiàn)較好的保留。這些因素給有機(jī)酸類化合物的準(zhǔn)確定量帶來了極大的挑戰(zhàn)。目前，有機(jī)酸類化合物的分析主要采用離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（IC-MS）、液相色譜結(jié)合低pH流動(dòng)相和液質(zhì)聯(lián)用配備新型的五氟苯乙基（PFP）色譜柱等。然而，這些方法存在對(duì)設(shè)備要求高、靈敏度低、操作繁瑣等缺點(diǎn)，難以滿足復(fù)雜樣品中各有機(jī)酸類化合物快速、靈敏定量分析的需求。雖然親水作用色譜法（HILIC）已被廣泛報(bào)道適用于大極性化合物的色譜分析，HILIC用于有機(jī)酸的定量分析卻鮮有報(bào)道。因此，本研究擬充分利用HILIC的優(yōu)點(diǎn)，建立快速、靈敏的HILIC-LC-MS方法，并將其用于復(fù)雜樣品的定量分析。

作為本課題組對(duì)參附注射液化學(xué)物質(zhì)組系統(tǒng)研究的一部分，在對(duì)參附注射液中的氨基酸、核苷、烏頭生物堿、人參皂苷等成分進(jìn)行了定性及定量分析的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步利用親水作用色譜法結(jié)合質(zhì)譜（HILIC.LC-MS）同時(shí)測(cè)定參附注射液中14種有機(jī)酸類成分的含量。

1材料

島津SHIMADZU高效液相色譜系統(tǒng)，配備2個(gè)LC-20AD_XR泵、SIL-20AC_XR自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-M20A PDA檢測(cè)器、DGU-20A3在線脫氣機(jī)和CBM-20A控制器；ABSciex 5500 Qtrap質(zhì)譜儀（美國ABSciex公司）配備ESI離子源和Analyst1.6.2軟件；Milli-Q超純水一體機(jī)（美國Millipore公司）。

14種有機(jī)酸對(duì)照品包括乳酸[L·（+）=lacticacid]、丙二酸（malonic acid）、馬來酸（maleic acid）、富馬酸（fumaric acid）、琥珀酸（succinic acid）、蘋果酸（D-malic acid）、己二酸（adipic acid）、莽草酸[（一）.shikimic acid]、奎尼酸（quinic acid）、酒石酸（D-tartaric acid）均來自于SUPELC0的有機(jī)酸套裝（美國Sigma-Aldrich公司）；咖啡酸（caffeic acid）和4.羥基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid）購自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；阿魏酸（ferulic acid）購自上海阿拉丁生化科技股份公司；肉桂酸（cinnamic acid）購自北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；內(nèi)標(biāo)物為4.氟肉桂酸（IS），購自北京百靈威科技有限公司。乙腈（Optima LC-MS級(jí)別，美國Thermo-Fisher公司），甲酸（Optima LC/MS級(jí)別，美國Thermo-Fisher公司）。其余試劑均為分析純。

10批次的參附注射液（SFI1～SFI10）均由華潤三九藥業(yè)有限公司（四川雅安）提供。

2方法與結(jié)果

2.1LC-MS條件

色譜柱為Waters XBridge BEH Amide（4.6mmx150mm，3.5μm，美國Waters公司），柱溫40℃；0.1%甲酸.水溶液（A）和0.1%甲酸.乙腈（B）作為流動(dòng)相；梯度洗脫（0～10.0min，98%-55%B；10.0～10.1min，55%～98%B；10.1-15.0min，98%B）；流速0.8 mL·min^-1；進(jìn)樣體積2.0μL。

質(zhì)譜檢測(cè)采用ESI負(fù)離子化模式；霧化氣N₂（GSl）50 psi（1psi=6.89 kPa）；輔助氣N₂（GS2）50psi；氣簾氣（CUR）35 psi；碰撞氣（CAD）high；噴霧電壓（IS）-4500V；離子化溫度（TEM）550℃；選擇離子檢測(cè)模式（selected ion momtoring，SIM）；射入電壓（EP）-10V；碰撞室射出電壓（CXP）-16V。各有機(jī)酸的定量離子對(duì)、保留時(shí)間及其他質(zhì)譜參數(shù)（脫簇電壓DP和碰撞能CE）見表1。典型色譜圖見圖1。

2.2溶液配制

2.2.1對(duì)照品溶液制備取乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、4.羥基苯甲酸、肉桂酸適量，精密稱定，分別用DMSO配制成20mmol·L^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取馬來酸、富馬酸、己二酸、莽草酸、奎尼酸、酒石酸、咖啡酸、阿魏酸適量，分別用DMSO配制成10mmol·L^-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃保存，備用。

取內(nèi)標(biāo)物4.氟肉桂酸（IS）適量，用DMSO配制成10 mmol·L^-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，再用40%乙腈逐步稀釋1000倍，配制成10μmol·L²的內(nèi)標(biāo)溶液，4℃保存，備用。

2.2.2供試品溶液制備吸取10批次參附注射液樣品各200μL，每批抽取3份，分別用40%乙腈稀釋5倍后，再吸取100μL再用10μmol·L^-1的內(nèi)標(biāo)溶液稀釋10倍，用0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3線性關(guān)系考察

吸取適量各對(duì)照品的儲(chǔ)備液，混合，并用40%乙腈稀釋至1.0mL，配制成乳酸、丙二酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、4.羥基苯甲酸、己二酸、肉桂酸、莽草酸、咖啡酸、奎尼酸、阿魏酸、酒石酸質(zhì)量濃度分別為144，41.6，11.6，116，94.4，268，55.2，29.2，296，34.8，36，192，38.8，45 mg·L^-1的混標(biāo)儲(chǔ)備液。用40%乙腈逐步倍半稀釋混標(biāo)儲(chǔ)備液，獲得系列濃度梯度的混標(biāo)溶液。分別吸取各濃度混標(biāo)溶液100μL，用10μmol·L^-1。的內(nèi)標(biāo)溶液稀釋10倍，即得系列濃度梯度的含內(nèi)標(biāo)的樣品溶液。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)含有相同濃度內(nèi)標(biāo)的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)進(jìn)樣3次。以各有機(jī)酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)（Y），各有機(jī)酸質(zhì)量濃度（μg·L^-1）作為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐步稀釋，分別取信噪比（S/N）約為3和10時(shí)各分析物的濃度作為檢測(cè)限（μg·L^-1，LOD）和最低定量限（μg·L^-1，LLOQ）。14種待測(cè)成分的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）、檢測(cè)限和最低定量限見表2。

2.4精密度試驗(yàn)

分別選擇高、中、低濃度標(biāo)曲樣品溶液作為質(zhì)控樣品，具體濃度見表3。取3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行日內(nèi)（intra-day）和日間（inter-day）精密度考察。按2.1項(xiàng)下LC-MS條件進(jìn)行樣品分析，日內(nèi)精密度通過每隔2h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣6次考察；日間精密度通過連續(xù)3d，1 d3次，采用同法測(cè)定考察，計(jì)算各有機(jī)酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表3可見各化合物的日內(nèi)精密度RSD≤13%，日間精密度RSD≤15%，均符合方法學(xué)的要求。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

取參附注射液1批次，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份，測(cè)定峰面積，并計(jì)算各待測(cè)化合物的含量，RSD為2.1%～8.6%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，8，12，18，24 h，按2.1項(xiàng)下LC-MS條件進(jìn)行樣品分析，計(jì)算各待測(cè)化合物含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，各RSD為3.7%～10%，表明各待測(cè)化合物在室溫下24 h之內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。

2.7加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)得含量的參附注射液樣品，分別精密加入適量體積的高、中、低3個(gè)濃度的混標(biāo)溶液，見表3，按2.2.2項(xiàng)下方法處理后按2.1項(xiàng)下LC-MS條件測(cè)定，每一濃度平行測(cè)定3次，計(jì)算平均回收率。由表3可見，除2種未檢測(cè)到的有機(jī)酸（己二酸和咖啡酸）外，其余12種有機(jī)酸的平均加樣回收率為86.33%一114.3%（RSD≤14%），表明加入不同濃度的混標(biāo)溶液后，各分析物的回收率較為穩(wěn)定，準(zhǔn)確度較好。

2.8樣品溶液含量測(cè)定

將10批參附注射液按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，依照2.1項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定，重復(fù)3次。將所得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各批次參附注射液中各有機(jī)酸類成分的含量。典型圖譜見圖1B，測(cè)定結(jié)果見表4。

3討論與結(jié)論

有機(jī)酸廣泛分布于中藥材及中藥復(fù)方制劑當(dāng)中。由于苯環(huán)等強(qiáng)發(fā)色團(tuán)的缺失，除少數(shù)芳香族有機(jī)酸外，該類化合物只具備較弱的紫外吸收。另一方面，由于羧基的存在，有機(jī)酸類化合物常表現(xiàn)出較強(qiáng)的極性。因此，常用的HPLC-UV配備RP-C₁₈色譜柱的方法難以實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸的全面準(zhǔn)確定量分析。本文采用HILIC色譜柱實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸類分析物的較好保留，并且采用質(zhì)譜檢測(cè)器，利用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式對(duì)各有機(jī)酸類化合物進(jìn)行靈敏地檢測(cè)，建立了參附注射液中14個(gè)有機(jī)酸類分析物同時(shí)定量分析的方法。實(shí)驗(yàn)過程中篩選了多種HILIC色譜柱，方法學(xué)考察和實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果表明，使用化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的三鍵鍵合的酰胺基鍵合相的Waters XBridge BEH Amide色譜柱對(duì)有機(jī)酸類化學(xué)成分保留能力強(qiáng)、柱流失低，能夠?qū)崿F(xiàn)多種有機(jī)酸的快速分離。已有文獻(xiàn)報(bào)道常通過調(diào)低流動(dòng)相pH（硫酸或磷酸鹽緩沖體系，pH<3）流動(dòng)相，對(duì)色譜柱損害較大。并且，由于非揮發(fā)性緩沖鹽的使用，使得無法采用蒸發(fā)光散色檢測(cè)器及質(zhì)譜檢測(cè)器。而本文采用0.1%甲酸作為流動(dòng)相改性劑，不僅能很好地降低色譜柱的損害，而且能滿足質(zhì)譜檢測(cè)器的要求。在對(duì)待測(cè)化合物離子對(duì)進(jìn)行篩選的過程中，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸類分析物由于結(jié)構(gòu)中存在羧基，響應(yīng)最好的離子對(duì)一般為[M-H]->[M-H-CO₂]-，能夠很好地與其他類型化合物進(jìn)行區(qū)分。

附子生物堿及人參皂苷類成分通常被認(rèn)為是參附注射液中的主要活性成分。然而，在系統(tǒng)研究過程中發(fā)現(xiàn)參附注射液中大量存在各種大極性成分，主要包括有機(jī)酸類、氨基酸類、核苷類等化學(xué)類型。本研究在定量分析參附注射液中附子生物堿、人參皂苷、氨基酸及核苷類成分的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立了一種可快速測(cè)定參附注射液中14種有機(jī)酸含量的色譜.質(zhì)譜聯(lián)用法。在所測(cè)的10批參附注射液中，蘋果酸、丙二酸、奎尼酸、乳酸和肉桂酸的含量均較大（>1.89mg·L^-1），而咖啡酸和己二酸均未檢測(cè)到。本文的定量分析結(jié)果對(duì)于參附注射液的系統(tǒng)質(zhì)量控制及用藥安全標(biāo)準(zhǔn)提升具有重要意義。同時(shí)，所建立的HILIC-LC-MS方法適用于參附等中藥注射劑中多種有機(jī)酸含量的同時(shí)測(cè)定。