交泰丸干預對氯苯丙氨酸致大鼠失眠的代謝組學研究

岳賀+周祥羽+李春苑+鄒忠杰+王淑美+梁生旺+龔夢鵑

[摘要]為了闡明交泰丸干預對氯苯丙氨酸致大鼠失眠的藥效及作用機制，SD大鼠一次性腹腔注射PCPA建立失眠模型，試驗期間觀察大鼠自發(fā)活動變化，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）水平，并利用核磁共振氫譜（H-NMR）代謝組學技術建立大鼠血清及海馬組織代謝物譜，分析交泰丸干預下大鼠自發(fā)活動，NGF水平及與失眠相關潛在生物標志物的變化。結果顯示交泰丸能明顯抑制失眠大鼠的自發(fā)活動，顯著升高失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清中NGF水平。交泰丸能對失眠所致大鼠血清和海馬組織代謝紊亂產(chǎn)生有效的干預，并分別對血清和海馬組織中6種和5種與失眠相關潛在生物標志物產(chǎn)生顯著的回調。研究表明交泰丸干預PcPA所致失眠的機制可能與調節(jié)NGF水平及調控機體氨基酸代謝、脂質代謝和膽堿代謝有關。

[關鍵詞]

交泰丸；失眠；代謝組學；核磁共振；對氯苯丙氨酸

失眠是一個嚴重的健康問題，隨著現(xiàn)代社會心理壓力增加，失眠發(fā)病率逐年升高，因此提高睡眠質量對公眾健康有著重要意義。交泰丸記載于明代《韓氏醫(yī)通》，由黃連和肉桂10：1配伍而成，方中黃連大寒大苦，清泄亢盛之心火，肉桂辛甘大熱，助陽補火，兩藥配伍交通心腎，對心腎不交型不寐具有顯著效果。全世建等研究顯示交泰丸治療失眠的機制與調節(jié)下丘腦.垂體.腎上腺軸（HPA軸）的功能以及相關神經(jīng)遞質如促腎上腺皮質激素（ACTH）、促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）、腎上腺分泌的皮質酮（CORT）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）和腎上腺素（E）有關。

代謝組學采用自上而下的策略，將機體作為一個整體性的系統(tǒng)，從代謝網(wǎng)絡的終端癥狀反映機體狀況，闡明藥物靶點相關干預。目前尚未見交泰丸治療失眠代謝組學研究的報道。本研究采用H-NMR代謝組學方法探討對氯苯丙氨酸（p-chlorophe.nylalanine，PCPA）致失眠及交泰丸干預下大鼠血清及海馬組織的代謝指紋譜變化，闡明交泰丸干預失眠藥效及作用機制。

1材料

1.1實驗動物雄性SD大鼠，180～200 g，購自中山大學實驗動物中心，SPF級，許可證號SCXK（粵）2011-0029。

1.2藥品與儀器黃連和肉桂飲片購自廣州采芝林大藥房，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院韓彬教授鑒定為正品；PCPA甲酯鹽酸鹽購自嘉興思誠化工有限公司（批號MAYA-CR-912，純度>98%）；蛋白含量測定和神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制劑Cocktail購自美國Biotool公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）和氘水（D：0）均購自美國Sigma公司；ELX.808酶標儀（美國BioTek公司）；Bruker AVANCEⅢ500 MHz全數(shù)字化超導核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）；UV-2401.PC型紫外.可見分光光度計（日本島津公司）。

1.3交泰丸水提液的制備精確稱取適量黃連、肉桂，以黃連和肉桂10：1混合，加10倍量水，浸泡1h，煎煮2次，每次1h，合并2次濾液，水浴濃縮至生藥濃度0.5 g·mL^-1。

2方法

2.1模型建立及給藥方法

參考文獻方法，將36只雄性SD大鼠置于12h光照和12h黑暗環(huán)境（溫度22℃，相對濕度50%）下自由飲食。適應3d后隨機分正常組、模型組和交泰丸組。交泰丸組灌胃交泰丸水提液（5 g·kg^-1），每天1次，連續(xù)5d，對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。實驗第3天，模型組和交泰丸組一次性腹腔注射PCPA甲酯鹽酸鹽（564 mg·kg^-1，相當于PCPA 450 mg·kg^-1）建立失眠模型，正常組一次性腹腔注射等體積生理鹽水。末次給藥3h后，每組一半動物用于測量下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清NGF水平，另一半動物用于血清及海馬組織代謝組學分析。

2.2大鼠自發(fā)活動試驗試驗開始前將大鼠置于干凈的飼養(yǎng)籠中提前適應3min，記錄各組大鼠2min內自發(fā)活動時間和前肢離地舉立次數(shù)作為正?；顒臃磻笜?。末次給藥后1h再次測量各組大鼠上述指標。

2.3大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清采集、處理及NGF水平檢測大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，收集的血液樣品經(jīng)凝固（4℃，60min）后離心（3500 r·min～，15min，4℃）得到血清。冰上分離出大鼠下丘腦、海馬和前額葉皮質，用冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙拭干稱重。各部分腦組織加入9倍量PBS（含1%蛋白酶抑制劑Cock.tail）冰水浴中勻漿，離心（3500 r·min^-1，15²in，4℃）得到上清液。血清和組織上清液按試劑盒說明書操作進行NGF指標檢測，并采用考馬斯亮藍法（Bradford法）測定組織樣品蛋白含量。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，多組均數(shù)間的兩兩比較采用Tukey檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2.4大鼠血清、海馬組織采集、處理及H-NMR測定大鼠乙醚吸入麻醉后眼眶后靜脈叢取血，收集的血液樣品經(jīng)凝固（4℃，60min）后離心（3500r·min^-1，15min，4℃）得到血清，將400μL血清加入到5mm NMR測試管中，然后加入50μL磷酸緩沖液（0.2mol·L^-1Na₂HP04-0.2 tool·L^-1振蕩混勻，待測。冰上分離出大鼠海馬組織，在冰水浴中用50%乙腈溶液勻漿（5 mL·g^-1海馬組織），離心（12 000 r·min^-1，10min，4℃）后取上清液750μL凍干，凍干物用450μL磷酸緩沖液（0.2 tool·L^-1磁管中。endprint

H-NMR測試時，實驗溫度為298 K，血清樣本采用Carr-Purcell-Meibom-Gill（CPMG）脈沖序列抑制血清中蛋白質及脂蛋白較寬的共振信號，總的回波時間100ms，弛豫延遲時間4s，采樣時間3.28 s。海馬組織樣本采用預飽和的DNOESY脈沖序列壓制水峰，弛豫延遲時間2s，采樣時間1.64 s。血清和海馬組織樣本譜寬10kHz，采樣點數(shù)64 K，采集次數(shù)128次。

2.5H-NMR圖譜處理及多變量數(shù)據(jù)分析采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進行傅立葉變換。采用軟件MestReNova 6.1（西班牙Mestrelab Research公司）對所獲譜圖進行手動相位和基線校正后，對血清和海馬組織樣本，分別參照乳酸的甲基共振雙重峰）和TSP對H-NMR譜的化學位移進行定標。在6 0.5～9.5區(qū)域按0.01等間隔分段積分，對于血清和海馬組織樣本，分別將區(qū)域64.68～5.22，6 4.53～5.30設為0積分段。然后將圖譜積分值輸出到Excel 2010（Microsoft Inc，Belle.vue，WA）中，對各分段積分值進行歸一化處理。歸一化所得數(shù)據(jù)乘以1萬后導入SIMCA-P12.0（Umetrics AB，Umea，Sweden），經(jīng)Pareto標度化預處理后，進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonalpartial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）。

3結果

3.1交泰丸對大鼠自發(fā)活動的影響試驗開始前各組大鼠自發(fā)活動時間和前肢離地舉立次數(shù)沒有明顯差異。末次給藥后1h，與正常組相比，模型組大鼠2min內自發(fā)活動時間和前肢離地舉立次數(shù)明顯增加（P<0.05），與文獻報道一致，表明失眠模型建立成功。交泰丸組較模型組自發(fā)活動明顯減少（P<0.05），表明交泰丸能明顯抑制失眠大鼠自發(fā)活動，見表1。

3.2交泰丸對失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清NGF水平的影響與正常組比較，模型組大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清中NGF水平均顯著性降低（P<0.05）；與模型組比較，交泰丸組大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清中NGF水平均顯著性升高（P<0.05），表明交泰丸能顯著回調失眠引起的大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清中NGF水平的降低，提示交泰丸能通過調節(jié)NGF水平來有效干預失眠，見表2。

3.3血清和海馬組織的H-NMR代謝物譜分析大鼠血清和海馬組織的H-NMR見圖1，2。代謝物譜峰的歸屬主要是依據(jù)化學位移值、峰的裂分隋況、耦合常數(shù)及參考文獻報道。

3.4PCPA致失眠模型大鼠血清和海馬組織代謝指紋譜的變化對照組和模型組的血清和海馬組織樣本點在PCI維可以完全區(qū)分開，說明PCPA誘導失眠后大鼠機體生理及物質代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變。本研究采用7倍交叉驗證法分別對OPLS-DA模型的可靠性進行驗證，得到了OPLS-DA模型的主要參數(shù)，血清：海馬組織。

從上述參數(shù)可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性，結果見圖3A，B。

3.5表征代謝物譜差異的潛在生物標志物本研究使用OPLS-DA模型中變量重要性投影（variableimportance in the projection，VIP）參數(shù)評價潛在的生物標志物。選取VIP>1的差異變量，再用t檢驗對篩選到的差異變量在對照組和模型組間進行驗證，只有P<0.05的差異變量才被認為是潛在的生物標志物。按照上述原則，最終在血清和海馬組織中分別篩選得到8種和7種具有顯著差異的化合物，見表3，4。

3.6交泰丸對PCPA致失眠模型大鼠血清和海馬組織代謝紊亂的干預作用交泰丸組樣本點與模型組樣本點可以完全分離，且與正常組樣本點接近，表明交泰丸能有效干預失眠。同時，交泰丸能分別使失眠大鼠血清和海馬組織中6種和5種潛在生物標志物顯著性回調（表3，4）。從上述結果可以看出交泰丸能對PCPA失眠模型大鼠血清和海馬組織代謝紊亂產(chǎn)生有效的干預作用。

4討論

PCPA誘導的大鼠失眠模型是目前被廣泛接受的用來研究失眠機制和藥效評價的模型之一。PC.PA可以選擇性作用于色氨酸羥化酶，抑制大鼠大腦5.HT合成，造成睡眠晝夜節(jié)律消失，幾乎達到完全失眠。本研究中模型組較正常組大鼠自發(fā)活動顯著增加，表明失眠模型建立成功。同時，失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清中NGF水平均顯著降低，并利用代謝組學技術分別從大鼠血清和海馬組織中篩選出8種和7種與失眠有關的潛在生物標志物。

NGF廣泛存在于參與睡眠.覺醒的膽堿能神經(jīng)元中，由海馬和腦皮質產(chǎn)生的NGF可通過膽堿能神經(jīng)逆行運輸至前腦基底核，維持膽堿能神經(jīng)元的存活和功能，NGF水平的降低會導致快動眼睡眠時間減少，覺醒時間延長。其通過與神經(jīng)元和軸突末梢的激酶受體結合，誘導快動眼睡眠，是快動眼睡眠產(chǎn)生和覺醒抑制作用機制的內在調節(jié)器。本研究中，模型組較正常組大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清的NGF水平均顯著降低，提示NGF水平與失眠這一過程密切相關。同時，交泰丸能明顯升高失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清中NGF水平，說明交泰丸干預失眠的機制與調節(jié)NGF水平有關。

本研究通過代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，失眠可引起機體氨基酸代謝紊亂，表現(xiàn)在模型組較正常組大鼠血清中谷氨酸、異亮氨酸水平升高，海馬組織中Ⅳ_乙酰天冬氨酸、?；撬崴缴撸彼?、氨基丁酸（GABA）水平降低。谷氨酸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元起興奮作用，是主要的興奮性遞質，其釋放的增加導致興奮性神經(jīng)毒性，在失眠中起重要作用。異亮氨酸屬于支鏈氨基酸，可促進蛋白質合成、降低分解，同時通過減少色氨酸人腦的含量來降低5.HT的濃度，進而抑制、減緩中樞疲勞。?；撬嵬ㄟ^作用于各種鈣離子通道來降低谷氨酸介導的鈣離子內流，穩(wěn)定細胞膜，同時阻礙Bcl-2和Bax蛋白二聚體的形成，逆轉Bcl-2/Bax比率，防止細胞凋亡。有研究顯示異相睡眠剝奪會導致大腦皮質?；撬崴矫黠@升高氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的抑制性遞質，能激活GABAa受體，使氯離子內流，形成抑制性突觸后電位，有研究發(fā)現(xiàn)失眠時大鼠腦內GABA水平降低，給予交泰丸治療能上調GABA水平。本研究中交泰丸能顯著下調失眠大鼠血清中谷氨酸、異亮氨酸以及海馬組織中?；撬崴?，上調海馬組織中丙氨酸、氨基丁酸水平，說明交泰丸干預失眠的機制與調節(jié)機體氨基酸代謝有關。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)，失眠大鼠血清中低/極低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸水平明顯升高，說明失眠可引起機體脂質代謝紊亂，經(jīng)交泰丸干預后，血清中低/極低密度脂蛋白回調趨近正常水平，說明交泰丸可通過調節(jié)脂質代謝來干預失眠。同時觀察到失眠大鼠血清中膽堿、磷酸膽堿以及海馬組織中甘油磷酸膽堿水平均顯著升高，提示失眠大鼠機體膽堿代謝紊亂。膽堿是細胞磷脂和神經(jīng)鞘磷脂的重要組成部分，是乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的前體物質，乙酰膽堿與學習記憶和認知功能密切相關，而磷脂酰膽堿參與細胞膜的構成。交泰丸能顯著回調失眠大鼠血清中膽堿、磷酸膽堿以及海馬組織中甘油磷酸膽堿水平，說明交泰丸可調節(jié)膽堿代謝紊亂而發(fā)揮干預失眠的效果。

綜上所述，交泰丸能明顯抑制失眠大鼠自發(fā)活動，并通過回調失眠大鼠下丘腦、海馬、前額葉皮質和血清中NGF水平來干預失眠。同時，交泰丸還能調節(jié)機體氨基酸代謝、脂質代謝和膽堿代謝達到干預失眠的效果。本研究以不同方法相互佐證、補充，系統(tǒng)研究交泰丸干預失眠的作用機制，為科學闡釋中藥理論與作用機制提供新思路。endprint