模式生物果蠅在中藥活性評價及其治療功效表征中的應用與展望

華永慶+朱悅+江帆+俞辰亞代+丁巖+段金廒

[摘要]果蠅作為生命科學領域中重要的模式生物，被廣泛用于人類疾病的研究，這些研究促進了對病理生理活動中相關蛋白分子表達和信號通路的理解，同時，也建立了諸多具有豐富遺傳特征的果蠅品系。人們發(fā)現(xiàn)，這些果蠅品系作為一類新興人類疾病模型，可以被應用于活性評價及藥物篩選。中藥活性評價技術與方法的匱乏是制約中醫(yī)藥發(fā)展的瓶頸問題之一。果蠅因其繁殖迅速、生命周期短、整體作用、品系豐富、與人類高度相關等特點，尤其適用于成分復雜的中藥的活性評價與篩選。該文就近年來利用果蠅進行的衰老、神經退行性疾病、代謝紊亂及糖尿病、睡眠障礙、腸道免疫、生殖、腫瘤、心臟功能等疾病模型的研究及藥物活性評價的研究進展進行了綜述。

[關鍵詞]

果蠅；模式生物；抗衰老；神經退行性疾??；代謝紊亂；睡眠障礙；腸道免疫

果蠅是生物學與基礎醫(yī)學研究領域中極為重要的模式生物。果蠅的全基因組測序已于21世紀初基本完成，近75%的人類疾病基因在果蠅中有相對應的直系同源物。同時，果蠅攜帶許多便于遺傳操作的表型標記、分子標記或其他特性的特征染色體?；谇逦倪z傳背景和便捷的遺傳操作，果蠅在發(fā)育生物學、生物化學、分子生物學、神經科學等領域逐漸得到了廣泛的應用。

果蠅具有繁殖速度快，生命周期短，生理結構簡單，繁殖量大，培養(yǎng)費用較低等特點，且與哺乳動物在生理學、生物學和神經系統(tǒng)機能等方面比較相似。果蠅每12～16周完成1個世代，1對果蠅可產400～500只卵，染色體僅有4對（容易改造）。在一個較短的生命周期內（25℃左右，8～12d），果蠅的發(fā)育經歷胚胎、幼蟲、蛹和成蠅期4個階段，每個階段都可被應用于不同目的的實驗研究。胚胎通常用于基礎發(fā)育研究，以檢測從神經元發(fā)育到整個發(fā)育模型的正確形成。幼蟲通常被用于研究一些生理過程以及覓食行為。蛹可用于研究某些特定的發(fā)育過程。果蠅成蟲大腦內約有10萬多個神經細胞，可形成復雜的神經回路和神經纖維網，借此調節(jié)各種行為，如飛行、打斗、梳理、覓食、學習和記憶、睡覺和晝夜節(jié)律等。因此，許多作用于哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的藥物被證實能在果蠅的大腦內發(fā)揮同樣的作用。近年來，果蠅作為新興整體動物模型，通過轉基因技術、基因定點敲除等有效的基因組操作，逐漸被應用于藥物活性的評價以及先導化合物的高通量篩選，不僅縮短了研究周期，也降低了科研成本。中藥，因其對人類健康的巨大貢獻，日益受到國內外研究者的重視。但中藥及方劑成分復雜，適宜的活性評價手段的缺乏仍是制約中醫(yī)藥研究的瓶頸問題。模式生物果蠅因具有上述特點，并可觀察藥物的整體作用，尤其適用于中藥復方、單味中藥及其成分的活性評價與篩選。

1果蠅在藥物活性評價中的應用

1.1果蠅在抗衰老藥物研究中的應用

果蠅作為一種真核多細胞生物，因其壽命短、繁殖力強，且其代謝、生理狀況和生長發(fā)育等也同哺乳動物基本相似，是研究壽命及抗衰老藥物的理想模型。影響衰老的因素很多，如遺傳、環(huán)境、代謝等，影響衰老的信號通路如胰島素信號通路（IIS）、雷帕霉素標靶（TOR）信號通路等也被證實在果蠅衰老中發(fā)揮重要作用。飲食限制、熱量限制以及自由基清除劑均被證實具有抗衰老作用。與人工合成的抗氧化劑相比，一些中藥經研究發(fā)現(xiàn)不僅具有較高的抗氧化活性，同時具有毒副作用較小的特點。果蠅壽命實驗表明，中藥復方如地黃飲子、參七片、烏杞膠囊及何首烏、當歸、黃芪、丹參等7味藥組成的補血復方確有延年益壽的功效。香椿子、六味地黃生物制劑正丁醇提取物、山楂醇提物通過抗氧化機制發(fā)揮延緩衰老作用。中藥中的多糖類成分能不同程度延長果蠅壽命，如補益類中藥黨參、短柄五加、長山藥、北五味子等，這一共性特征將有利于進一步探究補益類中藥延緩衰老作用的物質基礎。小分子多酚類物質白藜蘆醇，可激活長壽基因SIRT1，進而影響下游因子及其信號通路的表達，發(fā)揮抗氧化、抗自由基、免疫調節(jié)、抗炎、神經保護等作用，多方面協(xié)同產生延緩衰老的作用。王沂等從厚樸中分離提純厚樸酚，發(fā)現(xiàn)厚樸酚具有較強的過氧化物和羥基自由基清除能力，對果蠅細胞的生理及生化代謝過程起到保護作用，延緩細胞衰老，從而使果蠅壽命延長。

盡管許多中藥通過果蠅壽命實驗證實其抗衰老作用，但研究結果多數(shù)局限于對果蠅體內少數(shù)與自由基氧化相關的指標及給藥組存活數(shù)的測定，而未能深入探討果蠅壽命延長的分子機制。戴秋萍等利用基因芯片表達技術研究番茄紅素對果蠅壽命的影響，初步發(fā)現(xiàn)涉及信號傳遞、物質代謝、轉錄、腫瘤抑制等過程的98個基因在加入番茄紅素10d后上調。上述研究開啟了一種新的研究模式，應用組學技術可高效地確定藥效物質及其作用機制，便于深入細致地探討中藥的抗衰老作用。

1.2果蠅作為神經退行性疾病模型的研究及應用

人類神經退行性疾病主要是一類由神經元的退行性病變和凋亡導致個體死亡的疾病，包括阿爾茨海默病（Mzheimers disease，AD）、帕金森氏?。≒arkinsons disease，PD）、多聚谷酰胺疾病（polyglutamine disease）、肌萎縮性脊髓側索硬化癥（amyotro—phie lateral sclerosis）等。果蠅不僅具有與人類神經退行性疾病同源的致病基因，等基因，在發(fā)生過程等方面亦有與人類相似的表型，這使得果蠅成為研究人類神經退行性疾病極為簡單、高效的工具?？捎霉壯芯康纳窠浲诵行约膊∧Ｐ秃拖鄳墓壉硇鸵姳?。各類果蠅模型的表型存在一些共性特征，如視網膜變性、運動缺陷、爬坡缺陷和壽命縮短等方面。因此，治療神經退行性疾病的藥物篩選可選取特定表型作為評價指標，如觀察藥物對眼部粗糙病變、運動及爬坡缺陷的改善和正?；顒拥幕謴?。

利用分子遺傳學方法構建的Gal4/UAS系統(tǒng)可以使特定基因在果蠅的特定部位和不同的發(fā)育階段特異性表達，目前已通過正向遺傳學方法、逆向遺傳學方法及轉基因方法構建了包括AD，PD在內的多種神經退行性疾病的模型，這些模型的建立將有利于藥物作用靶點的發(fā)現(xiàn)和藥物進一步篩選。

目前藥物篩選中觀測較多的指標有視網膜的退化程度、眼部病變、壽命情況和行為學能力等。以轉基因果蠅為模型，楊巧巧等發(fā)現(xiàn)桑杞腦康顆粒對AD有認知改善作用。地黃飲子可通過上調轉Tau基因果蠅P13K，AKT，dTOR mRNA的表達，改善其學習記憶能力。進一步實驗表明，地黃飲子調控的dTOR信號通路中，4E-BP和p70S6k的mRNA和蛋白表達下調。Liu等通過AD果蠅模型篩選體系，評價臨床使用的23種植物藥的神經保護活性，篩選出5種具有顯著抗蛋白神經毒效應的提取物，包括芫荽、甘松、何首烏、地黃、花楸等。進一步實驗表明，何首烏提取物分離得到的單體成分二苯乙烯苷（2，3，5，4一四羥基二苯乙烯2-0-β-D葡萄糖苷）在果蠅和人類細胞上顯示出類似的抗蛋白神經毒的神經保護活性。姜黃素、藿香中提取的金合歡素、藍光激發(fā)的TPPS（四苯基卟吩）、強力霉素、y-分泌酶抑制劑L-685458、阿片受體拮抗劑nahrindole等單一中藥成分或化學物質均可調節(jié)β-淀粉樣蛋白（Aβ）的過度表達，緩解Aβ過表達引起的神經損傷，改善運動障礙或其他方面的缺陷。番茄紅素使Aβ果蠅腦組織病變空泡形成減少，同時使果蠅體內SOD活性增強，初步表明番茄紅素的神經保護作用機制可能與其抗氧化活性有關。上述研究證明了以轉基因神經退行性疾病果蠅模型篩選藥物的可行性，將其應用于具有神經系統(tǒng)藥理活性中藥如芳香化濕藥、安神藥、平肝熄風藥、補陰藥等藥物的篩選與研究，將有利于深入挖掘中藥對神經退行性疾病的治療作用。

利用果蠅研究神經退行性疾病取得了極大進展，在此過程中建立了大量的相關疾病模型品系，使得該類模型成為目前可以獲得的最為豐富且成熟的果蠅疾病模型。然而，這些模型也存在諸多缺點：果蠅疾病模型常在早期發(fā)育階段（如幼蟲、蛹、幼年成蟲等）就可產生顯著表型，而在人類相應疾病中則往往在老年階段才表現(xiàn)出明顯癥狀；果蠅眼睛和光感受器神經元對致病基因的毒性效應較為敏感，多數(shù)果蠅疾病模型選擇眼部粗糙病變等表型作為研究指標，然而，其眼部結構無法模擬人類大腦的復雜回路和病理生理學特征，故果蠅模型不能完全模擬人類疾病特點；果蠅的免疫系統(tǒng)相比哺乳動物更簡單，無法通過果蠅模型深入研究神經炎癥在退行性疾病中發(fā)揮的作用；果蠅和人類大腦在解剖學上也存在顯著不同，例如，果蠅大腦沒有黑質，利用果蠅研究黑質在多巴胺能神經元喪失的帕金森病中發(fā)揮的調節(jié)機制將受到限制；⑤果蠅和人類的細胞和分子淵控過程也有差異，一些參與調節(jié)特定疾病信號通路的關鍵分子，在果蠅中可能缺失，如a-synuclein，行且，從果蠅實驗中取得的研究成果可能與人類疾病通路不具有生物學相關性。

1.3果蠅作為代謝紊亂及糖尿病模型的研究與應用

果蠅的代謝過程、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和內分泌調節(jié)與人類具有高度的相關性，果蠅也被證實是研究代謝紊亂和糖尿病等疾病治療方法的有效模型。盡管果蠅沒有分泌胰島素的胰腺，也沒有肝臟，但果蠅大腦腦間部存在能夠分泌與代謝相關的胰島素的神經分泌細胞，其他的分泌細胞能分泌胰高血糖素樣的物質，它們在生理和基因上都表現(xiàn)出與脊椎動物內分泌相似的表征。去除果蠅胰島素分泌細胞，可導致其血淋巴內葡萄糖水平升高、脂肪循環(huán)加強和饑餓抵抗。果蠅體內的脂肪細胞和脂肪體與哺乳動物肝臟中的脂肪細胞具有相似的功能，參與脂代謝及糖原儲存，開通過與哺乳動物類似的胰島素機制進行調節(jié)。

果蠅模型近年來逐漸被用于糖尿病等代謝疾病治療藥物的篩選。果蠅可表達與人類磺酰脲類藥物受體及內向整流鉀通道同類蛋白，并形成ATP敏感鉀通道來調節(jié)某些果蠅激素（如脂動激素）的釋放。已在臨床使用的糖尿病治療藥物優(yōu)降糖和甲糖寧，即可通過與果蠅神經分泌細胞上ATP敏感鉀通道的相互作用，調節(jié)其體內的葡萄糖水平。近年研究證實，通過給予高糖、高脂膳食可導致果蠅產生與人類疾病相似的糖代謝異常。研究表明，丹參一三七復方、鬼箭羽配伍荔枝核醇提物、CoA前體一維生素B5可有效改善高糖模型果蠅的脂質代謝、糖代謝。植物雌激素櫻黃素、茶多盼類物質表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）分別通過上調長壽基因sirtuin 1（Sir2）、下調胰島素樣肽5和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶以及Upd2蛋白的表達，降低果蠅體內葡萄糖水平，改善果蠅健康并延長其壽命。本課題組采用高糖成功誘導了果蠅代謝紊亂模型，并發(fā)現(xiàn)丹參莖葉提取物具有一定降糖作用，證實該模型具有經濟、簡便、周期短、與人類高度相關等優(yōu)點，值得進一步探索及應用。

另外，果蠅胰島素的缺乏使其生長遲緩，體長變小，這在幼蟲和成蟲上都能體現(xiàn)。體長作為一個極易觀察的表型，有利于通過高通量篩選、發(fā)現(xiàn)促進胰島素分泌缺乏突變果蠅的生長的小分子化合物，其在藥物發(fā)現(xiàn)、篩選和驗證等階段均有較好的應用前景。Brookhean等還利用果蠅模型研究產婦肥胖對子代產生影響的作用機制，這也為研究肥胖的遺傳效應提供了新方法。

盡管果蠅代謝過程的分子機制在一定程度上與人類相似，但其調節(jié)代謝過程的結構基礎與人類也存在差別，因此在臨床有效的藥物在果蠅上未必能夠表現(xiàn)出作用。例如磺酰脲類藥物能有效作用于胰島素缺乏的果蠅，而二甲雙胍的有效性則無法通過果蠅的上述表型證實。

1.4果蠅作為睡眠模型的研究及應剛近幾年來，果蠅逐漸成為睡眠行為研究的新型模式生物。它與哺乳動物在睡眠醫(yī)學方面，有以下相似之處：①果蠅的睡眠具有持續(xù)性靜止和增高的激醒反應閾，且當果蠅被剝奪一個晚上的睡眠時，在第2天會表現(xiàn)出明顯的代償式休息延長，年幼果蠅比成熟果蠅睡得更多，年齡越大的果蠅有更多的片段式睡眠，這些行為與人類睡眠類似；②果蠅有睡眠壓力現(xiàn)象，即保持清醒狀態(tài)時間越長，睡眠時間越長，深睡期越長；③果蠅的睡眠受到晝夜節(jié)律和內環(huán)境的調節(jié)；④失眠的果蠅免疫系統(tǒng)會受到影響從而更易被感染，這與人類睡眠和免疫系統(tǒng)問的關聯(lián)性一致。通過監(jiān)測果蠅的活動節(jié)律，研究人員已通過果蠅鑒定出多個包括period（per），timeless（tim），clock（elk），cycle（eye）在內的時鐘基因。影響哺乳動物睡眠和覺醒的某些分子標記物在果蠅中也發(fā)揮類似的作用。如Fmrl基因影響與睡眠相關的突觸的重整化過程，使突觸強度增加、果蠅睡眠延長。

近年來，應用果蠅模型篩選治療睡眠疾病藥物、探索藥物作用機制的實驗相繼展開。采用光照等方法可建立果蠅睡眠剝奪模型。由此發(fā)現(xiàn)，四逆散凍干粉具有促進睡眠的作用，其作用機制是提高果蠅頭部5-HT的含量、上調果蠅腦內5-H。受體表達。刺五加不僅能夠促進睡眠，其作用機制涉及的基因已通過基因技術初步發(fā)現(xiàn)，它還對睡眠節(jié)律有調節(jié)作用，可減少24h持續(xù)黑暗環(huán)境下果蠅的片段化睡眠。酸棗仁皂苷A，B分別通過影響果蠅夜晚活動及白天睡眠共同改善果蠅睡眠?？Х纫蛲ㄟ^作用于多巴胺信號通路引發(fā)覺醒。

隨著研究深入，研究者發(fā)現(xiàn)睡眠不僅受年齡、晝夜節(jié)律、免疫反應、神經遞質、基因調控等因素影響，亦與代謝、學習記憶、應激反應、細胞膜興奮性等因素關系密切。采用果蠅作為模式生物研究睡眠仍存在一些瓶頸問題。以往多數(shù)研究中，研究者給予休息狀態(tài)的果蠅機械刺激，雖然可在行為水平證實果蠅休息狀態(tài)類似于哺乳動物睡眠狀態(tài)，但對于果蠅休息與睡眠狀態(tài)的界定仍不明確。雖然在果蠅群體監(jiān)控器中監(jiān)測果蠅運動或休息時間段的方法簡易可行，但是睡眠行為的特征及相關監(jiān)測指標還有待進一步發(fā)掘和完善。

1.5果蠅在腸道免疫實驗中的應用果蠅沒有B和T淋巴細胞，它主要依賴于抗菌肽介導的體液免疫和血細胞介導的細胞免疫。表皮及腸道等組織由于更容易接觸大量微生物，構成了抵抗微生物入侵的第一道防線。在果蠅體內，雙重氧化酶（DUOX）產生的活性氧（ROS）與核轉錄因子NF-KB信號通路產生的抗菌肽為腸道提供了廣譜抗菌作用。同時，腸道上皮細胞通過多種負調控機制來調節(jié)DUOX-ROS與NF-KB-AMP免疫系統(tǒng)，由此對共生菌群產生免疫耐受。

有研究者建立果蠅腸道氧化應激損傷模型，以果蠅生存率反映藥物對氧化應激損傷的作用，再從中分析果蠅壽命、腸道干細胞和成腸細胞數(shù)量的變化等來探討中藥的免疫調節(jié)機制。其中，紅景天可有效減少果蠅腸道上皮細胞的死亡并降低腸道上皮細胞內的ROS水平，保護行維持腸道形態(tài)。瓜蔞、紅花、川芎和菊花提取物可提高果蠅的腸道免疫功能。刺五加提取物對腸道免疫功能的改善作用與緩解腸壁細胞凋亡有關，行使體內部分抗菌肽表達增多。植物雌激素櫻黃素雖然能夠改善腸上皮細胞屏障功能，提高正常果蠅存活率和健康狀況，但其對于過氧化損傷的腸道并沒有保護作用，因此櫻黃素作為預防藥物使用可能優(yōu)于治療藥物。因此，除了應用果蠅模型進行改善腸道免疫功能藥物的篩選，腸完整性對藥物改善作用的影響也值得深入探索。

1.6果蠅在生殖系統(tǒng)功能評價中的應用

鑒于果蠅繁殖力強、繁殖周期短的顯著特點，果蠅常被應用于影響繁殖力藥物的篩選。通過果蠅繁殖力實驗，發(fā)現(xiàn)北五味子、短柄五加果可增強果蠅繁殖力。厚樸中的厚樸酚對果蠅的繁殖力及其產卵、蛹和幼蟲發(fā)育過程均有促進作用。甜葉菊糖苷對雄性果蠅生殖能力的損傷程度高于其對雌性果蠅的損傷，但215%的甜葉菊糖苷對果蠅行無明顯遺傳毒性。上述研究為篩選影響生殖力的藥物提供了更多途徑。果蠅模型也可用于研究藥物的遺傳毒性，可以顯著縮短藥物毒理實驗的研究周期。

1.7果蠅作為其他疾病模型的研究進展

果蠅作為模式生物在腫瘤學研究中獲得了較好的應用。果蠅在腫瘤學研究中具有如下優(yōu)勢：①在信號傳導通路方面，果蠅和人類有高度的保守性，因此以果蠅為模型的原癌基因研究也為人類癌癥研究做出了重大貢獻，如Patched作為腫瘤抑制基因的確定，源于對果蠅patched/hedgehog信號通路上Patched突變的深入研究，該信號通路上的其他基因也逐漸被發(fā)現(xiàn)與腫瘤形成有關；②果蠅基因的可操作性使果蠅易于研究基因的異常表達，這一特點極其適合正常致癌基因的異常活化或過度表達的研究；⑧與哺乳動物相比，果蠅相對缺乏基因冗余，這使得果蠅作為模型研究時更易檢測出相關的表型。果蠅也因具有開放的循環(huán)系統(tǒng)、不具有獲得性免疫功能等特點，而行非適合腫瘤發(fā)生的所有方面的研究，但這些利用果蠅進行的腫瘤方面的研究已取得豐碩成果，這必將推動其進一步在抗腫瘤藥物篩選中的應用。

果蠅在心臟功能研究中也得以應用。果蠅是具有心臟的無脊椎動物，且心臟組織分化精細，可用于研究心臟遺傳與發(fā)育基因調控。張艷陽等通過果蠅心力衰竭模型從164個果蠅第2號染色體缺失系中獲得33個表現(xiàn)心力衰竭頻率高的候選品系，為進一步完善果蠅心臟衰老模型奠定基礎。近年來，果蠅逐漸被用于研究胰島素信號通路、飲食限制、鉀離子通道等因素對心臟衰老的影響及作用機制。果蠅還可用于研究更高種屬心臟調節(jié)、心臟節(jié)律、心肌收縮的非自律結構。篩選發(fā)現(xiàn)抗氧化酶sod2果蠅突變體心臟功能衰退與正常果蠅生命后期心臟功能衰退具有相似特征，這些成果促進了人們對果蠅心臟功能模型的進一步研究。根據果蠅逆重力爬行的生理特性，鄭瀾等采用果蠅平臺運動，研究5種不同持續(xù)時間的運動方案對果蠅運動能力、生命周期及心臟功能的影響，研究初步表明堅持連續(xù)3周以上、每天適量運動2.5h，不僅可改善增齡衰退的運動能力，延長平均壽命，還能減少心臟衰竭的發(fā)生，起到保護心臟的功能。這一優(yōu)化的運動方案可輔助臨床藥物的治療作用。

2果蠅在中藥功效表征中的應用與展望

目前，果蠅在中藥功效表征中已經獲得較好的應用。果蠅模型尤其在補益類藥物功效的活性評價中應用較多。大量的實驗已經證實，此類藥物能夠延長壽命，行具有抗氧化，增強生殖能力，提高腸道免疫功能等作用?；钛鏊幬锛昂兄参锎萍に仡愃幬?，可表現(xiàn)出抗氧化，改善代謝紊亂等活性，使用果蠅衰老模型及高糖高脂負荷誘導的果蠅代謝紊亂模型或糖尿病模型可很好的驗證此類藥物的作用。滋陰類藥物常具對神經系統(tǒng)的保護作用，可用神經退行性疾病果蠅模型進行評價，如阿爾茲海默疾病模型、帕金森模型、亨廷頓疾病模型等，有較多的模型可供選擇，尤其是AD模型應用較多，許多中藥或植物提取物在此類模型上已被證實具有顯著的神經保護作用。厚樸、藿香等芳香化濕藥物具有抗癡呆作用，在果蠅的神經退行性疾病模型中也得以證實。安神類藥物的功效，可采用睡眠模型進行研究，如酸棗仁已被證實具有顯著的改善睡眠作用。上述模型能夠較好的體現(xiàn)中藥的活性及作用特點，在中藥的活性評價及篩選中具有廣闊的應用前景。

近一個世紀以來，果蠅在生物學研究的舞臺上占有舉足輕重的地位。由于其自身的諸多特點，隨著果蠅病理模型和轉基因果蠅品系的不斷豐富，果蠅模型在對生殖、免疫、神經、心血管等系統(tǒng)以及神經退行性疾病、代謝綜合征、睡眠等疾病機制的研究中發(fā)揮日趨重要的作用。另一方面，果蠅作為腫瘤、心臟衰老等模型的研究還有待深入。在中醫(yī)藥發(fā)展的新機遇下，中藥藥理研究面臨眾多新的考驗，而疾病動物模型的缺乏是制約其發(fā)展的關鍵科學問題。以中醫(yī)藥理論為指導，利用眾多符合中藥作用特點的果蠅病理模型，對中藥進行多指標活性評價及篩選，這不僅符合中藥藥理作用的多靶性、多重調節(jié)等特點，也體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀，可大大提高中藥活性篩選的效率，有利于進一步闡釋中藥及其復方的作用機制，推動中藥的產業(yè)化和國際化。