活體長爪沙鼠幽門螺桿菌檢測方法的建立

王存龍，李長龍，邢 進(jìn)，馮育芳，杜小燕，岳秉飛，賀爭鳴，陳振文*

(1．首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2．中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

技術(shù)方法

活體長爪沙鼠幽門螺桿菌檢測方法的建立

王存龍1，李長龍1，邢 進(jìn)2，馮育芳2，杜小燕1，岳秉飛2，賀爭鳴2，陳振文1*

(1．首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2．中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

目的 應(yīng)用巢式PCR方法通過胃液活體檢測長爪沙鼠幽門螺桿菌感染，從而建立可以持續(xù)監(jiān)測長爪沙鼠幽門螺桿菌感染的檢測技術(shù)。方法 體外培養(yǎng)幽門螺桿菌并接種至長爪沙鼠體內(nèi)，在感染后第10周使用普通PCR方法檢測長爪沙鼠胃液，使用巢式PCR方法對(duì)長爪沙鼠胃液、胃組織、十二指腸內(nèi)容物、結(jié)腸糞便進(jìn)行檢測；同時(shí)還利用快速尿素酶試驗(yàn)和血清ELISA方法等對(duì)比分析巢式PCR方法的準(zhǔn)確性，上述PCR產(chǎn)物均經(jīng)過測序驗(yàn)證。結(jié)果 普通PCR方法檢測胃液、巢式PCR方法檢測胃液、胃組織、十二指腸內(nèi)容物，結(jié)腸糞便以及快速尿素酶試驗(yàn)、血清ELISA檢測方法檢驗(yàn)結(jié)果陽性率分別為30%、100%、100%、90%、10%、100%和0%。比較不同檢測方法的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃液巢式PCR、胃組織巢式PCR和快速尿素酶試驗(yàn)均有100%的檢測率，普通PCR檢測胃液的方法、結(jié)腸糞便巢式PCR方法及血清學(xué)ELISA檢測方法檢測率均比較低。結(jié)論 胃液巢式PCR檢測方法由于其特異性、準(zhǔn)確性及靈敏性較高等特點(diǎn)可以用于長爪沙鼠幽門螺桿菌的長期檢測，特別是對(duì)于預(yù)防和治療幽門螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)具有重要價(jià)值。

長爪沙鼠；幽門螺桿菌；巢式PCR

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)形態(tài)特征與彎曲菌類似，為革蘭陰性菌。1983年由澳大利亞學(xué)者沃倫(J.Robin Warren)和馬歇爾(Barry J. Marshall)從胃炎和胃潰瘍病人胃黏膜組織中分離培養(yǎng)出來該細(xì)菌，研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌與胃部多種疾病具有相關(guān)性，二位學(xué)者因此獲得2005年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[1]。幽門螺桿菌是胃癌發(fā)生的重要的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)已經(jīng)將其列為一類致癌物質(zhì)[2]。長爪沙鼠(Mongolian gerbil)是幽門螺桿菌研究中重要的模型動(dòng)物。Honda在1998年利用長爪沙鼠成功復(fù)制了幽門螺桿菌感染的動(dòng)物模型，并且研究發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠在幽門螺桿菌感染后會(huì)出現(xiàn)胃炎、胃潰瘍、腸化生甚至胃癌等與人類相似的病理過程[3]。目前，長爪沙鼠幽門螺桿菌感染的檢測方法主要有細(xì)菌分離培養(yǎng)、胃組織切片以及血清學(xué)檢測等方法，尚缺少一種直接針對(duì)抗原、快速、有效的活體檢測方法。本文通過抽取胃液后進(jìn)行巢式PCR的方法對(duì)感染幽門螺桿菌的長爪沙鼠進(jìn)行檢測和評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株

普通級(jí)長爪沙鼠10只，雄性，8周齡，體重50～60 g。所有長爪沙鼠均來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中【SYXK(京) 2013-0005】。幽門螺桿菌采用ATCC43504菌株，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑和儀器

哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Oxoid公司，批號(hào)CM0331，英國)；無菌脫纖維羊血(北京路橋技術(shù)有限公司，中國)；MGC微需氧產(chǎn)氣袋與密封培養(yǎng)盒(三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社，日本)，小鼠幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司，批號(hào)：ml13306，中國)幽門螺桿菌診斷試劑盒(YZB/閩0455-2009，福建三強(qiáng)生物化工有限公司，中國)，微量樣品基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：DP316，中國)，PCR Master Mix (2X)預(yù)混酶(K0171，Thermo Scientific，美國)，低熔點(diǎn)瓊脂糖(A8350，Amresco，美國)，PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)，電泳儀(BIO-RAD公司，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，壓力蒸汽滅菌器(Triumph公司產(chǎn)品)，超凈工作臺(tái)，滅菌灌胃針，滅菌手術(shù)器械(眼科剪、眼科鑷等)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)和感染動(dòng)物

無菌脫纖維羊血加入高壓滅菌后的哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，傾注平皿，制成含5%脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂平板。幽門螺桿菌接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，至密封培養(yǎng)盒中，36℃微需氧培養(yǎng)48 h。菌苔用無菌生理鹽水制成含菌量為109CFU/mL濃度的菌液，分裝成小份，至-80℃冰箱備用，2周內(nèi)用完。取長爪沙鼠每次灌胃0.5 mL菌液，連續(xù)灌胃5次，每次間隔24 h。所有動(dòng)物灌胃前禁食不禁水24 h。灌胃結(jié)束后飼養(yǎng)10周。

1.3.2 胃液基因組提取方法

感染幽門螺桿菌長爪沙鼠禁食不禁水24 h，用高壓滅菌水灌胃0.5 mL，等1 min后用灌胃針伸入長爪沙鼠胃中抽取其胃中液體放入離心管中。胃液經(jīng)過離心，利用微量樣品基因組DNA提取試劑盒提取基因組。

1.3.3 巢式PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

使用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，第一次PCR反應(yīng)，引物F1：AGTAGGGCCATACA TAGAAA，引物R1：GACAAAACTCGTAACCGT，目的片段大小為499 bp， PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、51.3℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃終延伸5 min。第二次PCR反映，引物F2：CATAGTTGTCATCGCTTTT，引物R2：GCGTTGGTTGATAGGC，目的片段大小為100 bp，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、51.3℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃終延伸5 min。

1.3.4 檢測閾值的建立

檢測前對(duì)10只長爪沙鼠禁食不禁水24h。使用灌胃針給長爪沙鼠灌胃0.5 mL生理鹽水。等1 min左右后，再用灌胃針伸入長爪沙鼠胃中抽取其胃中液體放入離心管中。隔天重復(fù)操作，將所有長爪沙鼠胃液混合，取180 μL胃液加入濃度為2109CFU/mL濃度的幽門螺桿菌20 μL混勻后倍比稀釋，濃度分別為2108CFU/mL、2107CFU/mL、2106CFU/mL、2105CFU/mL、2104CFU/mL、2103CFU/mL、2102CFU/mL和210 CFU/mL的混合液。使用微量樣品基因組DNA提取試劑盒提取混合液基因組，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及測序。

1.3.5 幽門螺桿菌其他檢測方法

普通PCR方法檢測胃液：使用微量樣品基因組DNA提取試劑盒提取該液體基因組，只使用巢式PCR中第1次PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

將取胃液樣本完畢后的長爪沙鼠進(jìn)行眶靜脈采血，并斷頸椎處死后采集胃黏膜、十二指腸內(nèi)容物及結(jié)腸糞便，其中部分胃黏膜進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)；離心分離靜脈血血清，用于ELISA檢測。胃黏膜、十二指腸內(nèi)容物及結(jié)腸糞便中基因組DNA，進(jìn)行巢式PCR檢測。

快速尿素酶檢測方法：使用胃幽門螺桿菌診斷試劑盒(福建三強(qiáng)生物化工有限公司)，使用前去底物酶標(biāo)條的蓋子，每孔加入酶促反應(yīng)液2滴(或100 μL)，待藥膜完全溶解后，用潔凈鑷子將受感染動(dòng)物的胃黏膜放入藥液中，在10℃～30℃條件下孵育5min，觀察結(jié)果。采用目測法，襯白紙?jiān)谧匀还饩€下觀察各孔內(nèi)胃組織黏膜組織邊緣藥液顏色變化。幽門螺桿菌陰性為黃色，幽門螺桿菌陽性為淺紅色至玫瑰紅色。

血清Elisa檢測方法：通過眶靜脈取感染幽門螺桿菌長爪沙鼠血液500 μL，室溫靜置2 h，3000 r/min，15 min離心，取血清。按照小鼠幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行Elisa檢測，最終和陽性標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定長爪沙鼠是否感染幽門螺桿菌。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過檢測胃液中幽門螺桿菌濃度梯度確定胃液巢式PCR檢測方法的靈敏性，并通過胃液巢式PCR檢測方法檢測造模動(dòng)物的感染陽性率與常規(guī)方法檢測的感染陽性率進(jìn)行比較，確定該方法準(zhǔn)確性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR方法檢測胃液結(jié)果

使用第一對(duì)PCR引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增對(duì)胃液檢測，目的條帶為499 bp，對(duì)于擴(kuò)增出目的條帶的視為陽性。普通PCR方法檢測以感染動(dòng)物的胃液，結(jié)果顯示有3只動(dòng)物感染幽門螺桿菌，檢出率為30%(如圖1A)。

2.2 巢式PCR方法檢測不同樣品結(jié)果

幽門螺桿菌在消化道中均有分布。本研究通過對(duì)胃液、胃組織、十二指腸內(nèi)容物及結(jié)腸糞便進(jìn)行分析，篩選了適合檢測的消化道組織或內(nèi)容物。分別對(duì)胃液、胃組織、十二指腸內(nèi)容物及結(jié)腸糞便進(jìn)行巢式PCR檢測，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，對(duì)于擴(kuò)增出目的條帶的視為陽性。巢式PCR方法檢測胃液和胃組織結(jié)果顯示，10只動(dòng)物感染幽門螺桿菌，檢出率100%；巢式PCR方法檢測十二指腸內(nèi)容物結(jié)果顯示，有9只動(dòng)物感染幽門螺桿菌，檢出率為90%，巢式PCR方法檢測結(jié)腸糞便結(jié)果顯示，僅有1只動(dòng)物感染幽門螺桿菌，檢出率為10%(如圖1B-D)。

2.3 巢式PCR方法檢測閾值分析

PCR方法具有分高的靈敏性。本研究取不同濃度菌液提取的基因組進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳并測序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，幽門螺桿菌濃度為2108～2102CFU/mL的混合液中均擴(kuò)增出目的片段。將巢式PCR擴(kuò)增出的目的片段送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，使用Pubmed數(shù)據(jù)庫對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，確定巢式PCR擴(kuò)增片段為幽門螺桿菌特定片段。胃液巢式PCR檢測方法幽門螺桿菌最低濃度為2102CFU/mL。

2.4 PCR方法與快速尿素酶試驗(yàn)、血清學(xué)Elisa檢測方法的結(jié)果分析

為了驗(yàn)證巢式PCR方法的準(zhǔn)確性，本研究選用快速尿素酶試驗(yàn)和血清學(xué)ELISA檢測方法作為對(duì)比。結(jié)果用檢測陽性結(jié)果所占比例表示，分別說明各種方法的檢測陽性率。快速尿素酶檢測方法按其說明書要求通過試劑顏色改變判斷其感染情況。檢測結(jié)果對(duì)比如表1所示，快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10只動(dòng)物感染幽門螺桿菌，檢出率100%。血清學(xué)ELISA檢測方法檢測結(jié)果顯示有0只動(dòng)物感染幽門螺桿菌，檢出率為0%。

注：A. 胃液一次PCR產(chǎn)物電泳圖；B. 胃液巢式PCR產(chǎn)物電泳圖；C. 胃組織巢式PCR產(chǎn)物電泳圖；D. 腸內(nèi)容物巢式PCR產(chǎn)物電泳圖；E. 糞便巢式產(chǎn)物PCR電泳圖；目的條帶均為100bp。圖1 通過不同方法檢測感染幽門螺桿菌長爪沙鼠的檢測結(jié)果Notes. A. Electrophoresis of gastric juice PCR products; B. Electrophoresis of gastric juice nested PCR products; C. Electrophoresis of gastric mucosa nested PCR products; D. Electrophoresis of duodenum content nested PCR products; E. Electrophoresis of colon stool nested PCR products; All the target bands were 100 bp.Fig.1 Helicobacter pylori in the Mongolian gerbils detected by different detection methods

注：A. 不同幽門螺桿菌濃度巢式PCR產(chǎn)物電泳圖，目的片段大小為100 bp，1～8孔濃度分別為2108CFU/mL、2107CFU/mL、2106CFU/mL、2105CFU/mL、2104CFU/mL、2103CFU/mL、2102CFU/mL和210CFU/mL；B. 巢式PCR擴(kuò)增出100 bp條帶測序結(jié)果。圖2胃液巢式PCR檢測方法檢測閾值的測定Notes. A. The nested PCR electrophoresis map of different concentrations of H. pylori. The target band is 100 bp. The concentration of H. pylori in the 1～8 wells were 2108 CFU/mL, 2107 CFU/mL, 2106 CFU/mL, 2105 CFU/mL, 2104 CFU/mL, 2103 CFU/mL, 2102 CFU/mLand 210 CFU/mL, respectively; B. Sequencing results of nested PCR products of 100bp.Fig.2 Determination of the threshold of gastric juice nested PCR detection method

編號(hào)Number胃液普通PCRGastricjuiceconventionalPCR胃液巢氏PCRGastricjuicenestedPCR胃組織巢氏PCRGastricmucosanestedPCR腸內(nèi)容物巢式PCRDuodenalcontestsnestedPCR結(jié)腸糞便巢式PCRColonstoolnestedPCR快速尿素酶檢測方法Rapidureasetest血清Elisa檢測方法SerumELISA1++++++-2++++-+-3-+++-+-4-+++-+-5-+++-+-6-+++-+-7++++-+-8-+++-+-9-+++-+-10-++--+-

注：“+”為陽性，“-”為陰性。

Note.“+”means positive；“-” means negative.

3 討論

長爪沙鼠由于其在幽門螺桿菌感染后會(huì)出現(xiàn)胃炎、胃潰瘍、腸化生以及胃癌等一系列病理學(xué)變化的特點(diǎn)已經(jīng)在幽門螺桿菌的相關(guān)研究中廣泛使用[3]。目前雖然已經(jīng)有多種幽門螺桿菌檢測方法，但大多數(shù)檢測方法會(huì)對(duì)動(dòng)物造成較大的損傷甚至死亡，不能很好地用于動(dòng)物的長期監(jiān)測。例如細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，其作為幽門螺桿菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但需處死動(dòng)物，分離細(xì)菌難度較高，且較為耗時(shí)[4]。胃組織切片染色方法也可以作為幽門螺桿菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但其同樣需要處死動(dòng)物，過程比較復(fù)雜，對(duì)于組織切片要求較高，并且需要有臨床經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行判斷，假陰性率較高[5]。血清學(xué)抗體檢測方法已經(jīng)廣泛用于人類和大、小鼠幽門螺桿菌感染的檢測[7]。但血清學(xué)抗體檢測方法是一種間接檢測方法，動(dòng)物感染幽門螺桿菌后數(shù)周后才會(huì)產(chǎn)生抗體，這將造成檢測結(jié)果的假陰性率較高。現(xiàn)有檢測方法不足制約了使用長爪沙鼠研究幽門螺桿菌。因此，急需一種能比較準(zhǔn)確的檢測方法檢測幽門螺桿菌感染情況并能對(duì)其進(jìn)行長期檢測。PCR技術(shù)因其靈敏，快速，方便等特點(diǎn)已經(jīng)在細(xì)菌檢測中廣泛使用[6]。本研究建立了胃液PCR檢測方法用于檢測長爪沙鼠幽門螺桿菌感染情況，該方法具有良好的靈敏性、準(zhǔn)確性以及特異性，不僅如此，該方法對(duì)于長爪沙鼠的損傷甚微，可以作為長期監(jiān)測類似長爪沙鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物幽門螺桿菌感染的無創(chuàng)檢測方法。

由于長爪沙鼠胃液比較少，無法直接使用灌胃針抽取胃液，故本實(shí)驗(yàn)采取先灌胃無菌水后再抽取胃液。但由于灌胃使用的水會(huì)稀釋胃液中幽門螺桿菌濃度，加之普通PCR方法檢測敏感性低，很難根據(jù)普通PCR的電泳圖判斷其感染情況(如圖1A)。而巢式PCR技術(shù)使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的目的基因片段，能夠增加PCR的特異性和靈敏性[8]。所以通過使用巢式PCR的方法，顯著提升了該檢測方法的準(zhǔn)確性和特異性(如圖1B)。

在本研究中，利用巢式PCR方法檢測動(dòng)物不同部位幽門螺桿菌感染情況的陽性率存在差異。其中胃液、組織尿素酶方法和胃組織檢測效率最高，陽性率為100%。十二指腸內(nèi)容物陽性率為90%，結(jié)腸和糞便檢測效率很低。可能有以下原因?qū)е?。幽門螺桿菌進(jìn)入胃內(nèi)則粘附于黏膜表面的粘液層，寄居于胃小凹及胃黏膜上皮層，特別是胃竇小彎側(cè)[9]。所以巢式PCR方法檢測胃液和胃組織的陽性率較高。在自然環(huán)境或者灌胃過程中會(huì)有部分幽門螺桿菌隨水或食物進(jìn)入到十二指腸與胃組織交界處，所以巢式PCR方法檢測十二指腸的腸內(nèi)容物時(shí)也可以檢測到幽門螺桿菌，但其準(zhǔn)確性不如前三種檢測方法。長爪沙鼠主要生活在荒漠干旱地帶，其糞便含水量較低[10]，不利于細(xì)菌生存，巢式PCR方法檢測結(jié)腸部幽門螺桿菌陽性率較低，故長爪沙鼠糞便巢式PCR方法不適合作為一種活體檢測幽門螺桿菌的方法。

巢式PCR方法檢測胃液幽門螺桿菌陽性率與快速尿素酶試驗(yàn)結(jié)果相一致，陽性結(jié)果率均為100%，證明胃液巢式PCR檢測方法的準(zhǔn)確性較高。相比與快速尿素酶試驗(yàn)需處死動(dòng)物后檢測，胃液巢式PCR檢測方法能夠在對(duì)動(dòng)物造成極微小的損傷情況下檢測動(dòng)物幽門螺桿菌感染情況。而血清ELISA檢測結(jié)果陽性率較低，主要因?yàn)殚L爪沙鼠對(duì)于幽門螺桿菌產(chǎn)生的抗體與小鼠存在一定差異，所以使用小鼠幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒并不適用于長爪沙鼠。

基于以上不同檢測方法的比較，胃液PCR檢測幽門螺桿菌的方法有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。(1)活體檢測：相對(duì)于傳統(tǒng)的幽門螺桿菌檢測方法，該方法通過胃液對(duì)其進(jìn)行檢測，對(duì)動(dòng)物傷害較小，能夠保證動(dòng)物的存活，動(dòng)物可以繼續(xù)用做其他實(shí)驗(yàn)。這對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)特別是與幽門螺桿菌研究相關(guān)的實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。(2)操作簡單：采用2×PCR Master Mix預(yù)混酶，需2步PCR就可得到幽門螺桿菌感染情況。(3)檢測速度快：相對(duì)于傳統(tǒng)方式，該方法能夠較快速直觀的反映出幽門螺桿菌感染情況。(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)定較為簡單、客觀：該方法結(jié)果的判讀是根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖中條帶目的條帶的有無，使檢測結(jié)果的判讀更加簡單、客觀。(5)成本低廉，本實(shí)驗(yàn)只需要微量樣品DNA提取試劑盒和普通PCR引物及DNA聚合酶。相對(duì)于細(xì)菌體外培養(yǎng)等方式，成本相對(duì)較低。(6)抗原檢測：相對(duì)于抗體等間接檢測方法，該方法是通過對(duì)胃液中幽門螺桿菌進(jìn)行檢測，其準(zhǔn)確性相對(duì)較高。

Watanabe等[11]研究發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠人工感染幽門螺桿菌，其在6周定植率可以達(dá)到100%。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)通過人工感染的發(fā)方法復(fù)制長爪沙鼠感染幽門螺桿菌動(dòng)物模型，在第10周時(shí)其定植率高達(dá)100%。據(jù)此分析，長爪沙鼠是幽門螺桿菌的易感動(dòng)物。雖然有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)長爪沙鼠在自然環(huán)境中很少感染幽門螺桿菌[14]。但是，人感染幽門螺桿菌情況較為普遍，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約有50%～70%的人群感染幽門螺桿菌，有些國家甚至達(dá)到100%[12]，其主要通過口-口途徑和糞-口途徑傳播[13]。因此，長期在人工飼養(yǎng)環(huán)境下，長爪沙鼠有可能會(huì)通過人感染幽門螺桿菌。研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染會(huì)導(dǎo)致長爪沙鼠體內(nèi)氧自由基聚集[15]，IL-12和IFN-γ表達(dá)量上升等[16]，這將對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性造成嚴(yán)重影響。此外，感染幽門螺桿菌后，長爪沙鼠可以通過口-口途徑和糞-口途徑傳播給幼鼠，導(dǎo)致其在動(dòng)物群體長期感染并影響動(dòng)物質(zhì)量和研究結(jié)果[17]。據(jù)此，長爪沙鼠種群中應(yīng)控制幽門螺桿菌的感染。

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Establishment of a detection method forHelicobacterpyloriin living Mongolian gerbil

WANG Cun-long1, LI Chang-long1, XING Jin2，F(xiàn)ENG Yu-fang2，DU Xiao-yan1，YUE Bing-fei2，HE Zheng-ming2，CHEN zhen-wen1*

(1.School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China；2. Institute for Laboratory Animal Resources,National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050)

Objective To establish a detection technique forH.pylori(HP) infection in Mongolian gerbils using nested PCR technique. MethodsH.pyloriwas culturedinvitroand inoculated into Mongolian gerbils. At the 10th week after infection, the HP in the gastric juice of Mongolian gerbil was detected by conventional PCR assay and the gastric juice, gastric mucosa, duodenal contents and colon stool were examined by nested PCR. Rapid urease test and ELISA were used to analyze the accuracy of the nested PCR assay. All of the PCR products were verified by sequencing. Results The positive rate of gastric juice detected by conventional PCR was 30%, while the positive rates of gastric juice, gastric mucosa, duodenal contents and colon stool detected by nested PCR were 100%, 100%, 90%, and 10%, respectively. The positive detection rates of rapid urease test and serum ELISA were 100% and 0%, respectively. Comparing the results of different methods, both the positive rates of gastric juice and gastric mucosa detected by nested PCR and the detection rate of rapid urease test were 100%, but the results of conventional PCR detection of gastric juice, the nested PCR detection result of stool in colon and of serum ELISA assay were lower than other methods. Conclusions Due to its high accuracy and sensitivity, the nested PCR assay of gastric juice can be used for the long-time detection ofH.pyloriinfection in Mongolian gerbils, especially useful in the experiments of prevention and treatment ofH.pyloriinfection.

Mongolian gerbil;Helicobacterpylori; Nested-PCR

國家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAI09B01)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572348)；北京自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(714100)。

王存龍(1991-), 男, 碩士研究生,研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)。 E-mail:cunlongwang@qq.com

陳振文(1959-), 男, 博士,教授, 研究方向：分子遺傳學(xué)。 E-mail:czwen@ccmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0075-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.014

2016-07-25