試驗(yàn)相關(guān)因素對(duì)SD大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

程 潔，環(huán) 飛，靳蘇香，錢 雯，鐘義紅，王玉邦*

(1.江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，南京 211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166)

研究報(bào)告

試驗(yàn)相關(guān)因素對(duì)SD大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

程 潔2，環(huán) 飛1，靳蘇香1，錢 雯1，鐘義紅1，王玉邦1*

(1.江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，南京 211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166)

目的 了解麻醉劑和應(yīng)激反應(yīng)對(duì)動(dòng)物生理方面的影響，為動(dòng)物福利、化合物的毒性檢測方法規(guī)范化研究提供了可資借鑒的經(jīng)驗(yàn)。方法 選擇SPF級(jí)SD大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，按性別(A)、禁食時(shí)間(B)、麻醉方式(C)和采血方式(D)4個(gè)因素，根據(jù)不同因素交互影響分為24組，采集各組SD大鼠血液標(biāo)本測定血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類等指標(biāo)。結(jié)果 各因素對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果影響的主次順序?yàn)镈 > C > A > B，各因素水平白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果是雄性大鼠>雌性大鼠，靜脈血>動(dòng)脈血，水合氯醛>戊巴比妥鈉>不麻醉。各因素對(duì)白細(xì)胞分類結(jié)果影響的主次順序?yàn)镃 > D=A=B，各因素水平白細(xì)胞分類結(jié)果是水合氯醛 > 戊巴比妥鈉=不麻醉。各因素對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與血紅蛋白水平結(jié)果影響的主次順序?yàn)镃 > D=A=B，各因素水平紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與血紅蛋白水平是戊巴比妥鈉 > 水合氯醛 > 不麻醉，禁食時(shí)間各組間血液學(xué)指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 禁食對(duì)血液學(xué)指標(biāo)無影響，血液學(xué)指標(biāo)存在性別、動(dòng)靜脈差異；對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類的影響水合氯醛麻醉大于戊巴比妥鈉麻醉，而對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白水平的影響是戊巴比妥鈉麻醉大于水合氯醛麻醉，兩種麻醉方式各有優(yōu)缺點(diǎn)。

SD大鼠；血液學(xué)指標(biāo)；麻醉

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液生理生化參考值的建立是判斷動(dòng)物健康狀況和選擇合格動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)，是臨床醫(yī)療和生物醫(yī)學(xué)研究中的重要數(shù)據(jù)。在食品、藥品以及獸藥或農(nóng)藥產(chǎn)品的亞急性、亞慢性以及慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，大鼠是使用最為普遍的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，而血液常規(guī)指標(biāo)是這些毒性試驗(yàn)中必不可少的檢測項(xiàng)目[1]，能夠提示毒性反應(yīng)的可能靶器官。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利要求、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉方式、采血方式以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液生理生化指標(biāo)的檢測方法和檢測儀器發(fā)生了很大的變化，與傳統(tǒng)方法所得檢測數(shù)據(jù)相比有一定差異[2, 3]。因此，有必要對(duì)動(dòng)物的血液生化指標(biāo)進(jìn)行重新檢測，以確定本實(shí)驗(yàn)室正常背景值。本實(shí)驗(yàn)使用全自動(dòng)生化儀器，測定了SPF級(jí)SD大鼠血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類等血液學(xué)指標(biāo)，為建立標(biāo)準(zhǔn)化SD大鼠基礎(chǔ)數(shù)據(jù)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級(jí)SD大鼠，8～10周齡(雌性體重190～210 g、雄性體重280～300 g)，雌雄各120只，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供【SCXK(滬)2013-0016】。動(dòng)物飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生分析檢測中心屏障系統(tǒng)【SYXK(蘇)2015-0009】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。主要儀器為Siemems ADVIA 2120i血液分析儀，試劑均由Siemems公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇性別(A)、禁食時(shí)間(B)、麻醉方式(C)和采血方式(D)4個(gè)因素為考察因素，根據(jù)不同因素交互影響分為24組。具體分組方式如下：選擇240只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分組，先按性別分成雌雄2組，每組120只；再按不禁食(0 h)和禁食(16 h)分為2組，每組60只；再按水合氯醛麻醉、戊巴比妥鈉麻醉和不麻醉分成3組，每組20只；最后按腹主動(dòng)脈采血和眼眶后靜脈叢采血分成2組，每組10只。在上述不同試驗(yàn)條件下，采集SD大鼠血液標(biāo)本，采用Siemems ADVIA 2120i血液分析儀測定各組SD大鼠血液標(biāo)本血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 軟件進(jìn)行均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，首先采用SPSS提供的一般線性模型的“Univariate”過程對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P< 0.05差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類結(jié)果

各組大鼠血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類結(jié)果見表1。

2.2 各因素對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中提供的一般線性模型“Univariate”過程，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(見表1)進(jìn)行方差分析。SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2、3。可以從表2、3結(jié)果直觀分析，A因素、C因素、D因素對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果影響顯著(P< 0.05)，而B因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響，各因素對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果影響的主次順序?yàn)镈 > C > A > B。從單因素量表上可以看出各因素水平對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果影響的差異，雄性組>雌性組，靜脈血組>動(dòng)脈血組，水合氯醛組>戊巴比妥鈉組>不麻醉組，禁食組=不禁食組。

表1 各組別血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果

表2 單因素統(tǒng)計(jì)量表(因變量：白細(xì)胞計(jì)數(shù))

2.禁食時(shí)間(B)

3.麻醉方式(C)

4.采血方式(D)

2.3 各因素對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)分類的影響

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果直觀分析，C因素對(duì)白細(xì)胞分類中的淋巴細(xì)胞、中性細(xì)胞百分率結(jié)果影響顯著(P< 0.05)，而A、B、D因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響，各因素對(duì)白細(xì)胞分類結(jié)果影響的主次順序?yàn)镃 > A=B=D。從單因素量表上可以看出，各因素水平對(duì)白細(xì)胞分類中的淋巴細(xì)胞、中性細(xì)胞百分率結(jié)果影響的差異，雄性組=雌性組，靜脈血組=動(dòng)脈血組，水合氯醛組>戊巴比妥鈉組=不麻醉組，禁食組=不禁食組。

表3 方差分析表(因變量：白細(xì)胞計(jì)數(shù))

a確定系數(shù)=0.992(校正確定系數(shù)=0.987)。

aR Squared=0.992 (Adjusted R squared=0.987).

2.4 各因素對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白水平的影響

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果直觀分析，C因素對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平結(jié)果影響顯著(P< 0.05)，而A、B、D因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響，各因素對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果影響的主次順序?yàn)镃>A=B=D。從單因素量表上可以看出，各因素水平對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平結(jié)果影響的差異，雄性組=雌性組，靜脈血組=動(dòng)脈血組，戊巴比妥鈉組 > 水合氯醛組 > 不麻醉組，禁食組=不禁食組。

3 討論

大鼠作為醫(yī)學(xué)研究中數(shù)量最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如何采集血樣成為科學(xué)研究中一項(xiàng)最基本，也是最重要的技術(shù)和方法。眼眶后靜脈叢采血關(guān)鍵是適用于實(shí)驗(yàn)中期需保留活體動(dòng)物的采血。而腹主動(dòng)脈采血作為一種終結(jié)采血法，常用于鼠類大量采血。眼眶后靜脈叢采血會(huì)造成動(dòng)物較大的痛苦，產(chǎn)生興奮與排尿、排便等現(xiàn)象，從而影響部分血液學(xué)、生化指標(biāo)改變[4]。本試驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)末梢靜脈血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于動(dòng)脈血，這可能由于末梢血血管管徑狹窄，循環(huán)不如主動(dòng)脈暢通，且局部溫度偏低，血液成分部分沉積[5-7]，從而使末梢靜脈血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比動(dòng)脈血高。我們還發(fā)現(xiàn)雄性SD大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于雌性大鼠，而其它血液學(xué)指標(biāo)影響較小。麻醉劑經(jīng)腹腔注射后，吸收入血后產(chǎn)生麻醉作用，同時(shí)血液中的麻醉劑也影響儀器對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的檢測，大量研究表明，許多麻醉劑對(duì)白細(xì)胞分類、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平有明顯影響[8, 9]。本次試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)一致，麻醉劑的使用對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)無影響，而對(duì)白細(xì)胞分類有明顯影響：水合氯醛麻醉組中性細(xì)胞百分率低于戊巴比妥鈉麻醉組和無麻醉組，水合氯醛麻醉組淋巴細(xì)胞百分率高于戊巴比妥鈉麻醉組和無麻醉組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平戊巴比妥鈉組>水合氯醛組>不麻醉組。

綜上所述，禁食對(duì)血液學(xué)指標(biāo)無明顯影響，血液學(xué)指標(biāo)存在性別、動(dòng)靜脈差異；對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類的影響水合氯醛麻醉大于戊巴比妥鈉麻醉，而對(duì)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白計(jì)數(shù)的影響是戊巴比妥鈉麻醉大于水合氯醛麻醉，兩種麻醉劑各有利弊，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求合理選擇麻醉劑。在建立本實(shí)驗(yàn)室正常背景值范圍時(shí)，應(yīng)考慮到因性別、采血方式等因素造成的血液學(xué)指標(biāo)差異，為動(dòng)物福利與化合物毒性檢測方法規(guī)范化研究提供了可資借鑒的經(jīng)驗(yàn)。

[1] GB 15193.22-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)[S].

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Effects of experiment-related factors on hematological parameters in SD rats

CHENG Jie2, HUAN Fei1, JIN Su-xiang1, QIAN Wen1, ZHONG Yi-hong1, WANG Yu-bang1*

(1. The Safety Assessment and Research Center for Drugs of Jiangsu Province, Nanjing 211166, China;2. School of Public Health, Nanjing Medical University, Nanjing 211166)

Objective To study the effects of experiment-related factors on hematological parameters in SD rats, analyze the data difference and causes, understand the effects of anesthetics and stress responses on the physiological aspects of animals, and to provide a reference for the standardization of animal welfare and compound toxicity testing methods. Methods According to gender (A), fasting time (B), anesthesia (C) and blood collection mode (D), SPF SD rats were divided into 24 groups. Blood samples were collected from each group. Then, red blood cell count, hemoglobin levels, white blood cell count and classification indicators were measured. Results The primary and secondary order of the factors affecting the white blood cell count was D > C > A > B, and the levels of white blood cell count of each factor were male rats > female rats, and venous blood > arterial blood, chloral hydrate > pentobarbital sodium > no anesthesia. The primary and secondary order of the factors affecting the white blood cell classification was C > D=A=B, and factors affecting the levels of white blood cell classification were chloral hydrate > pentobarbital sodium > no anesthesia. The primary and secondary order of the effects of the factors on the red blood cell count and hemoglobin level was C > D=A=B, and the levels of red blood cell count and hemoglobin level were pentobarbital sodium > chloral hydrate> no anesthesia. There was no significant difference in the blood indexes between the different fasting time groups. Conclusions There is no effect of fasting on hematological parameters, but there are differences in the blood parameters between arteries and veins. The effect of chloral hydrate anesthesia on the count and classification of white blood cells is greater than that of pentobarbital sodium. The effect of chloral hydrate anesthesia on the red blood cell count and hemoglobin level is greater than that of pentobarbital sodium. The two kinds of anesthesia methods have their own advantages and disadvantages.

Sprague Dawley rats; Hematology parameters; Anaesthesia

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

程潔(1978-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：衛(wèi)生毒理學(xué)。E-mail：chengjie@njmu.edu.cn

王玉邦(1965-)，男，博士，副教授，研究方向：生殖毒理。E-mail：wyb@njmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0043-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.008

2016-07-18