黃岑苷對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的影響

任應國，張保朝，賈東佩，胡 科

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 河南 南陽 473000)

研究報告

黃岑苷對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的影響

任應國，張保朝，賈東佩，胡 科

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 河南 南陽 473000)

目的 觀察不同濃度黃岑苷(baicalin)對實驗性自身免疫腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠模型的作用，并研究其初步機制。方法 建立實驗性自身免疫性脊髓炎小鼠模型，免疫后第3天給予高低劑量黃岑苷灌胃，每天1次，共20 d。對小鼠活動進行神經(jīng)功能評分，TUNEL染色檢測脊髓組織細胞凋亡情況，ATP水平檢測試劑盒檢測脊髓組織ATP含量水平，免疫印跡法(Western blot)檢測Bax、Bcl-2、cleaved cas-9和cleaved cas-3蛋白表達水平。結(jié)果 黃岑苷能夠提高實驗性自身免疫腦脊髓炎小鼠神經(jīng)功能，延后發(fā)病時間；黃岑苷干預后，Tunel染色結(jié)果顯示脊髓組織凋亡細胞數(shù)下降，ATP水平下降，免疫印跡法結(jié)果顯示Bcl-2的蛋白表達顯著上升，Bax、cleaved cas-9和cleaved cas-3的蛋白表達顯著下降。結(jié)論 黃岑苷可通過抑制線粒體內(nèi)源性凋亡途徑抑制細胞凋亡，保護線粒體，提高實驗性自身免疫腦脊髓炎小鼠神經(jīng)功能，為預防疾病提供了實驗理論依據(jù)。

黃岑苷；實驗性自身免疫腦脊髓炎；細胞凋亡；線粒體；多發(fā)性硬化

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病，特征性病理改變主要有白質(zhì)脫髓鞘、炎性細胞浸潤和軸突破壞等[1]。多發(fā)性硬化患者多數(shù)表現(xiàn)為反復發(fā)作的神經(jīng)功能障礙，病情嚴重者喪失正常的自理能力，對患者和家屬帶來諸多不便。實驗性自身免疫性腦脊髓炎是多發(fā)性硬化的動物模型，主要病理特征是免疫細胞穿過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]。

黃岑苷是提取自黃岑的有效單體成分，近年來研究表明黃岑苷具有抗氧化、抗炎、抗菌以及抗凋亡的作用[3, 4]。研究指出黃岑苷通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2平衡，抑制線粒體內(nèi)源性凋亡途徑減輕腎小管上皮細胞的凋亡[5]。黃岑苷通過下調(diào)NF-κB信號通路的相關(guān)因子，對腦缺血大鼠具有抗炎與抗凋亡的作用[6]。目前尚未有關(guān)于黃岑苷對多發(fā)性硬化作用的報道，本實驗通過建立實驗性自身免疫性脊髓炎小鼠模型，觀察不同濃度黃岑苷對實驗性自身免疫性脊髓炎小鼠的作用，并對初步機制進行探究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雌性C57B/6小鼠60只，8～10周齡，體重18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司【SCXK(瀘)2012-0002】，所有小鼠飼養(yǎng)于南陽市中醫(yī)藥學校藥理實驗室【SYXK(豫)2013-0016】，溫度22～25℃，相對濕度40%～80%環(huán)境中，自由飲食。

1.1.2 實驗試劑

黃岑苷百日咳毒素購自中國食品藥品檢定研究院；結(jié)核桿菌購自DIFCO公司；完全弗氏佐劑購自Sigma公司；MOG33-35多肽購自西安聯(lián)美生物科技有限公司；ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；TUNEL試劑盒購自Roche公司；Bax、Bcl-2、cleaved cas-9、cleaved cas-3和GADPH抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立

參照文獻[7]，用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)將MOG33-55多肽稀釋成3 mg/mL；將結(jié)核桿菌放入完全弗氏佐劑(CFA)中，使結(jié)核桿菌最終濃度為4 mg/mL，與MOG33-55多肽等體積混合，用注射器于冰上抽打至油包水狀態(tài)，作為誘導EAE的抗原乳劑。于小鼠背部、頸部、腋窩和蹊部四個點皮下注射抗原乳劑0.2 mL/只，并于免疫當天和第2 天分別給予腹腔注射百日咳毒素每只500 ng。

1.2.2 實驗分組與給藥

將小鼠隨機分為四組，每組15只小鼠，正常對照組(control)，無任何干預措施，給予正常飲食；自身免疫性腦脊髓炎模型組(EAE)，相應時間點灌胃相同體積生理鹽水；黃芩苷低劑量組(Bai-L)和黃芩苷高劑量組(Bai-H)，造模后第3 天開始，分別給予黃岑苷5 mg/kg和20 mg/kg灌胃，每天1次，共給藥20 d。

1.2.3 神經(jīng)功能評分

觀察各組小鼠的活動情況，參照胡曉等[7]的標準進行神經(jīng)功能評分：0分：行動正常，無明顯異常；1分：尾部無力；2分：雙后肢輕微無力；3分：雙后肢嚴重癱瘓；4分：雙后肢癱瘓；5分：瀕臨死亡或死亡。對麻醉清醒后的大鼠進行神經(jīng)功能評分，1-3分為造模成功，0、4分為造模不成功。

1.2.4 脊髓取材與TUNEL染色檢測

給藥完成后，10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉處死，打開胸腔暴露心臟，由心尖部插管至升主動脈，剪開右心耳，0.01 mol/L PBS約50 mL迅速灌注至循壞血液洗凈，分成兩份，一份保存于-80℃液氮中，另一份用4%多聚甲醛固定，制作成石蠟切片，用4% PFA/KPBS溶液浸染15 min，滴入20 μg/mL蛋白酶K工作液，室溫孵育10 min，4%PFA固定5 min，加入100 μL平衡液8 min，滴加TUNEL反應液，并于濕盒中避光孵育45 min，37℃，終止反應，KPBS洗滌，滴入DAPI染液，孵育15 min，封片，置于光學顯微鏡下觀察，以視野內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值表示。

1.2.5 脊髓組織的ATP水平檢測

按照ATP檢測試劑盒操作，將上述存放于液氮中的脊髓組織去除，每20 mg組織樣品加入0.2 mL裂解液，冰上用勻漿器勻漿20 min，4℃離心10 min，取上清液，加入0.1 mL ATP檢測工作液至檢測孔，放置3 min，加入10 μL樣品或標準品，依據(jù)標準曲線計算出樣品ATP的濃度。

1.2.6 免疫印跡法(Western blot)

提取細胞蛋白定量，調(diào)整蛋白量。取等量裂解產(chǎn)物，加入體積∶上樣緩沖液(1∶4)進行SDS-PAGE電泳。電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應一抗4℃孵育4 h，TBST洗滌3次，每次10 min；再加入相對應二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，暗室中進行熒光顯色。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的癥狀與神經(jīng)功能評分

對照組小鼠活動狀態(tài)良好，無發(fā)??；EAE組小鼠發(fā)病高峰在免疫后10d發(fā)病，并在發(fā)病后2～4 d內(nèi)達發(fā)病高峰；與EAE組小鼠相比，Bai-L組與Bai-H組小鼠的神經(jīng)功能評分明顯降低，發(fā)病時間延后，并在短時間內(nèi)恢復接近正常水平，如圖1所示。

圖1 各組小鼠的神經(jīng)功能評分Fig.1 Neurological function scores of the mice in each group

2.2 Tunel染色檢測細胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示，EAE組小鼠TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著高于control組(P< 0.05)；給予黃岑苷干預后，Bai-L組與Bai-H組的TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著低于EVE組(P< 0.05)，并隨黃岑苷劑量增大而減少。如圖2所示。

注：A：control正常對照組；B：EAE模型組；C：Bai-L黃芩苷低劑量組；D：Bai-H黃芩苷高劑量組。下圖同。*P<0.05，vs 正常對照組；#P<0.05，vs 模型組圖2 Tunel染色檢測細胞凋亡情況Note. A: Control; B: EAE model group; C: Low dose baicalin group; D: High dose baicalin group. The same as in Fig.3 and 4.*P < 0.05, vs. the control group; #P < 0.05, vs. the model group.Fig.2 Cell apoptosis in the neurons of mouse brains

2.3 各組小鼠脊髓組織ATP含量水平的檢測

結(jié)果顯示，與control組相比，EAE組小鼠脊髓組織中ATP含量水平顯著下降(P<0.05)；與EAE組相比，Bai-L組與Bai-H組小鼠脊髓組織中ATP含量水平顯著上升(P<0.05)，并隨黃岑苷濃度的增大而上升程度增大。如表1所示。

2.4 Bax與Bcl-2蛋白表達水平的變化

與control組相比，EAE組的Bax蛋白表達顯著上升(P< 0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P< 0.05)；與EAE組相比，Bai-L組與Bai-H組的Bax蛋白表達顯著下降(P< 0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著上升(P<0.05)。

表1 各組小鼠脊髓組織ATP含量水平

注：*P<0.05，vs 正常對照組；#P< 0.05，vs 模型組。

Note.*P<0.05, vs. the control group;#P< 0.05, vs. the EAE model group.

注：*P<0.05，vs正常對照組；#P<0.05，vs模型組圖3 Bax與Bcl-2蛋白表達水平的變化Note. *P < 0.05, vs. the control group; #P < 0.05, vs. the EAE group.Fig.3 Protein expression of Bax and Bcl-2 in the mice

2.5 Cleaved cas-9和Cleaved cas-3蛋白表達水平的變化

與control組相比，EAE組的cleaved cas-9和cleaved cas-3蛋白表達顯著上升(P<0.05)；與EAE組相比，Bai-L組與Bai-H組的cleaved cas-9和cleaved cas-3蛋白表達顯著下降(P<0.05)，下降幅度與黃岑苷濃度呈正比。

注：*P<0.05，vs 正常對照組；#P<0.05，vs 模型組圖4 Cleaved cas-9和Cleaved cas-3蛋白表達水平的變化 Note. *P<0.05, vs. the control group;#P<0.05, vs. the EAE group.Fig.4 Protein expression of cleave cas-9 and cleaved cas-3 in the mice

3 討論

多發(fā)性硬化是導致青中年非創(chuàng)傷性神經(jīng)殘疾的主要原因之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，但病因尚不明確，普遍認為多發(fā)性硬化的發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，約有15%～20%的患者具有多發(fā)性硬化家族史，大多數(shù)患者家庭有不超過兩個或三個受影響的人[8]。近年來，認為氧化應激反應對于多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。

本實驗建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型，免疫3 d后給予黃岑苷灌胃，觀察小鼠的發(fā)病情況，數(shù)據(jù)顯示EAE小鼠普遍在免疫后10 d發(fā)病，而給予黃岑苷干預后，發(fā)病時間顯著延遲，且小鼠臨床癥狀明顯減輕，并逐漸平緩。提示黃岑苷具有改善EAE小鼠神經(jīng)功能的作用。

線粒體是ATP生成的主要來源，ATP水平能夠反映線粒體的功能狀況[9]。線粒體損傷引起線粒體膜通透性增加，鈣離子內(nèi)流增加，促進氧自由基的生成，使合成ATP產(chǎn)生障礙，最終導致細胞凋亡[10]。有報道指出氧化損傷的強信號存在于多發(fā)性硬化活動性病灶區(qū)域，而非活動性病灶顯示較弱的氧化損傷信號[11]。本實驗顯示實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓組織中ATP含量水平顯著降低，TUNEL染色結(jié)果顯示陽性凋亡細胞數(shù)增多，在給予黃岑苷干預后，顯著升高EAE組小鼠脊髓組織的ATP含量水平，但凋亡細胞數(shù)顯著減少，并與黃岑苷劑量呈負相關(guān)。提示黃岑苷可能通過提高ATP的含量，具有保護線粒體的作用，同時通過抑制細胞凋亡，起到發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用，從而提高EAE小鼠的神經(jīng)功能，對實驗性自身免疫性腦脊髓炎具有一定的改善作用。

Bcl-2家族中的促凋亡因子Bax與抗凋亡因子Bcl-2之間相互作用，當Bcl-2激活后，導致線粒體外膜孔道形成，促使cyt-c轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中，激活caspase-9，被激活的caspase-9進而激活caspase-3，從而誘導細胞凋亡[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)EAE小鼠Bcl-2、cleaved caspase-9與cleaved caspase-3的表達在免疫后升高，與線粒體損傷相對應，黃岑苷顯著抑制Bcl-2、cleaved caspase-9與cleaved caspase-3的表達，抑制線粒體損傷，減少促凋亡因子的水平同時提高抗凋亡因子的水平，從而減少細胞凋亡的發(fā)生。提示黃岑苷可能通過線粒體內(nèi)源性凋亡途徑抑制EAE小鼠脊髓組織細胞凋亡，從而發(fā)揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的改善作用。

綜上所述，本實驗觀察黃岑苷提高EAE小鼠的神經(jīng)功能，通過發(fā)揮對線粒體的保護作用，抑制線粒體途徑的細胞凋亡，為黃岑苷用于臨床研究提供了一定的實驗理論基礎(chǔ)。

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Protective effect of Baicalin on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice

REN Ying-guo, ZHANG Bao-chao, JIA Dong-pei, HU Ke

(Department of Neurology, Nanyang Centre Hospital, Nanyang 473000, China)

Objective To observe the effects of different concentrations of baicalin on the mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and to explore its mechanisms. Methods A mouse model of EAE was established with MOG33-55 peptide and bacillus Calmette-Guerin (BGG) vaccine with complete Freund adjuvant (CFA). At the third day after immunization, high and low doses of baicalin were administered to the mice intragastrically once a day for 20 days. The neurological function of mice was evaluated. TUNEL staining was used to detect apoptosis in the spinal cord tissue. The level of ATP in spinal cord tissue was detected by an ATP determination kit. Furthermore, the protein expressions of Bax, Bcl-2, cleaved cas-3 and cleaved cas-9 were detected by western blot, respectively. Results Baicalin improved the neurological function and delayed the onset time in EAE mice.After the treatment with baicalin, the TUNEL staining showed that the number of apoptotic cells in spinal cord was decreased, and the ATP level decreased. Western blot revealed that the protein expression of Bcl-2 was significantly increased, while the protein expression of Bax, cleaved cas-3 and cleaved cas-9 were significantly decreased. Conclusions Baicalin can reduce apoptosis by inhibiting mitochondrial endogenous apoptosis pathway, protect the function of mitochondria and improve the neurological function inEAE mice, therefore, provide experimental evidence for the disease prevention.

Baicalin; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Cell apoptosis;Mitochondria; Multiple sclerosis

任應國(1973-)，男，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科疾病基礎(chǔ)與臨床研究。Email: renyingguo@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0052-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.010

2016-04-29