實(shí)驗(yàn)用小型豬乙型腦炎病毒的分離鑒定

王 吉，付 瑞，李曉波，王淑菁，鞏 薇，衛(wèi) 禮，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院國家實(shí)驗(yàn)動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

研究報告

實(shí)驗(yàn)用小型豬乙型腦炎病毒的分離鑒定

王 吉，付 瑞，李曉波，王淑菁，鞏 薇，衛(wèi) 禮，岳秉飛*，賀爭鳴*

(中國食品藥品檢定研究院國家實(shí)驗(yàn)動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

目的 了解小型豬感染乙型腦炎病毒株的特點(diǎn)。方法 豬腦組織經(jīng)過處理，接種BHK21細(xì)胞，進(jìn)行病毒培養(yǎng)、間接免疫熒光試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、電鏡觀察，及通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增新分離毒株E區(qū)段和PrM區(qū)段核苷酸序列，測序后進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果 25只豬腦組織接種BHK21細(xì)胞，有3個組織處理液能使BHK21細(xì)胞發(fā)生圓縮、集聚等病變；3個組織接種的BHK21病變細(xì)胞滴片進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，均產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光反應(yīng)；中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3株新分離株中和效價均為1∶64；電鏡下可見直徑40nm左右球型病毒粒子；RT-PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與疫苗株E區(qū)段核苷酸比較同源性均為95%；3株新分離株均為GIII型乙腦病毒。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)表明小型豬場存在乙型腦炎病毒感染，為GIII型乙型腦炎病毒。

乙型腦炎病毒；分離；鑒定

流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員，乙型腦炎病毒基因?yàn)閱喂烧淩NA，病毒顆粒呈球形，有包膜，直徑40～ 60nm，病毒粒子呈20面體對稱[1-4]。由乙型腦炎病毒引起的流行性腦炎簡稱乙腦，乙腦是一種人畜共患的自然疫源性疾病，是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的急性傳染病，帶毒豬是本病的主要傳染源[4，5]。因此防治乙腦不僅可以減少養(yǎng)豬業(yè)的損失，并通過豬的免疫預(yù)防，可控制本病在豬及人群中的流行。

我國于1949年在北京首次分離到乙腦病毒，隨后在其他地區(qū)也相繼分離到該病毒[6]。乙腦主要流行于亞洲國家及地區(qū)，近年來流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，已經(jīng)擴(kuò)展到澳大利亞，韓國、泰國、印度尼西亞的爪哇、俄羅斯西伯利亞的濱海地區(qū)等相繼有乙腦的報道。我國除新疆、西藏、青海省外，其余各省均有發(fā)病流行，是嚴(yán)重危害公眾健康的重要傳染病，乙腦已成為世界關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一[1，6-9]。國內(nèi)外對JEV的研究較多，在我國也從多個省份通過不同途徑分離得到JEV，但從豬腦中分離到JEV的報道還不多[5]，尤其是從小型豬腦中分離JEV目前還沒有報道。為了解北京小型豬感染JEV的特征，加強(qiáng)小型豬的免疫預(yù)防，本研究從北京市某小型豬場的3頭豬腦組織中分離到的3株乙型腦炎病毒，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

DMEM培養(yǎng)基：HyClone公司產(chǎn)品；胎牛血清：杭州四季青公司產(chǎn)品；免疫熒光素(山羊抗豬IgG-FITC)：KPL公司產(chǎn)品；豬抗JEV血清及豬陰性血清：中國動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)診斷室提供；細(xì)胞固定液：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)研究中心電鏡室提供；乳倉鼠腎細(xì)胞(Baby Hamster Syrian Kidney， BHK21)。BHK21細(xì)胞：本室凍存； JEV毒株(Nakayama-NIH)、兔抗JEV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照血清：由本院病毒一室提供；25只豬腦組織：北京某小型豬場提供的-70℃凍存腦組織；RNA快速提取試劑盒：購自德國Qiagen公司；Taq HS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10×PCR buffer、100bp DNA marker：均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR儀：美國Bio-Rad公司MYCYCLER；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-Rad公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國 Kodak公司 GL212Pro； DNA序列分析軟件：DNA Star MegAlign軟件。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離

取的25個凍存的豬腦組織(編號為1～25)，無菌條件下用PBS研磨，經(jīng)1000 r/min離心10 min，除菌過濾。

將樣品處理液接種長滿單層的BHK21細(xì)胞，置于37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變，并記錄結(jié)果。每隔2～3 d換液1次，10 d后如出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)則進(jìn)行盲傳，盲傳至3代仍無CPE出現(xiàn)，則視為分離陰性。出現(xiàn)CPE的細(xì)胞，待CPE達(dá)到80%～ 90%收凍。凍融3次后繼續(xù)傳代，傳至3代，仍有CPE出現(xiàn)，則視為分離陽性[10-12]。

1.2.2 免疫熒光試驗(yàn)

將連續(xù)傳至第3代的細(xì)胞滴片，與1∶10稀釋的豬JEV陰性血清和豬JEV陽性血清進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。同時設(shè)正常BHK21細(xì)胞片和JEV感染BHK21細(xì)胞片作為陰性抗原片和陽性抗原片對照。在陰性抗原對照和陽性抗原對照成立的條件下，樣品片與JEV陰性血清和JEV陽性血清均無綠色熒光反應(yīng)，該樣品判為JEV陰性；樣品片與JEV陰性血清無綠色熒光反應(yīng)，與JEV陽性血清有綠色熒光反應(yīng)，該樣品判為JEV陽性。

1.2.3 中和試驗(yàn)

用兔抗JEV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和細(xì)胞維持液分別與JEV細(xì)胞毒(JEV感染BHK21細(xì)胞毒)、與經(jīng)細(xì)胞試驗(yàn)和免疫熒光試驗(yàn)檢測JEV陽性的3只豬腦組織接種的P5代BHK21細(xì)胞毒，以1∶2～1∶512混合，37℃作用30 min后，接種BHK21細(xì)胞。同時設(shè)JEV標(biāo)準(zhǔn)毒株對照和正常BHK21對照，每天觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察7d并記錄結(jié)果。

1.2.4 病毒形態(tài)的鑒定

將細(xì)胞試驗(yàn)分離陽性的樣品細(xì)胞毒繼續(xù)接種BHK21細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)80%～90%時，將細(xì)胞瓶內(nèi)液體棄掉，加入0.25%胰酶進(jìn)行消化。用PBS將分散的細(xì)胞吹打懸浮于滅菌離心管中，1000 r/min離心10 min后，棄上清；將細(xì)胞用PBS再次懸浮，1000 r/min離心10 min后，棄上清，用細(xì)胞固定液將細(xì)胞懸浮，準(zhǔn)備用透射電鏡鑒定病毒形態(tài)。電鏡圖片委托中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)研究院電鏡室制作。

1.2.5 乙腦病毒分離株E基因和PrM基因的RT-PCR擴(kuò)增

(1)引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中已發(fā)表的乙腦病毒核苷酸序列，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中E1-F/E1-R用于擴(kuò)增E基因，PrM1-F/PrM1-R用于擴(kuò)增PrM基因，引物的序列和位置見表1。

表1 用于擴(kuò)增E基因和PrM基因的引物序列及位置

(2)病毒分離株RNA的提取

3株乙腦病毒分離株、JEV標(biāo)準(zhǔn)株、正常BHK21細(xì)胞，各取0.3 mL模板，按QIAGEN試劑盒說明書的操作步驟提取病毒RNA。

(3)反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄體系為：5×RNA PCR buffer 2.5 μL、dNTPsmixture 2.5 μL、RNase free dH2O 9.5 μL、隨機(jī)引物1 μL、RNase inhibitor 1 μL、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、病毒RNA 8 μL，反應(yīng)條件為：37℃ 90 min、42℃ 15 min、95℃5 min。

(4)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

以E1引物及PrM1引物，對分離株分別進(jìn)行E基因和PrM基因擴(kuò)增。利用Taq酶進(jìn)行PCR，其反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL，dNTP(mmol)2.5 μL,上下游引物(E1-F/E1-R或PrM1-F/PrM1-R)各1 μL，cDNA產(chǎn)物2.5 μL，Taq酶0.5μL，加去離子水總體積為25 μL，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72延伸5 min。

(5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

反應(yīng)結(jié)束后，取5 μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果。將電泳結(jié)果陽性的PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果與Genbank中JEV核酸序列進(jìn)行比對，從分子的角度來驗(yàn)證分離株是否是JEV。

1.2.6 乙腦分離株E基因的核苷酸同源性分析

利用Chen等建立的乙腦病毒基因分型方法，選擇乙腦病毒E區(qū)的部分核苷酸序列，對3株分離株與已知的23株乙腦病毒代表株序列一起進(jìn)行核苷酸同源性分析，構(gòu)建乙型腦炎病毒遺傳進(jìn)化樹[8，9，13]。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離

25個豬腦組織接種BHK21細(xì)胞，有3個腦組織(編號分別為3、12、23)接種的BHK21細(xì)胞72 h之內(nèi)發(fā)生明顯CPE，而且CPE達(dá)到80%以上，病變細(xì)胞表現(xiàn)圓縮，形成空斑。其他22個豬腦接種的BHK21細(xì)胞盲傳3代后，均無CPE出現(xiàn)，視為分離陰性。

2.2 病毒的鑒定

2.2.1 免疫熒光試驗(yàn)

取25個豬腦組織接種的BHK21細(xì)胞滴片做免疫熒光試驗(yàn)，有3、12、23號腦組織出現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光反應(yīng)，其他22個腦組織無綠色熒光反應(yīng)。

2.2.2 中和試驗(yàn)

3、12、23號腦組織感染細(xì)胞毒與兔抗JEV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)的中和效價均為1∶64。

2.2.3 病毒形態(tài)的鑒定

電鏡下可見正常細(xì)胞內(nèi)無病毒顆粒出現(xiàn)，核膜完整，見圖5。感染細(xì)胞核膜已被破壞，病毒顆粒有規(guī)律的排列在細(xì)胞核膜周圍，病毒顆粒呈圓形，外周有囊膜和纖維突起，直徑40 nm左右，見圖6。所分離到的3株病毒分別命名為 JDY1、JDY2、JDY3。

圖1 正常 BHK21細(xì)胞Fig.1 Normal BHK21 cells

圖2 3號腦組織感染BHK21細(xì)胞Fig.2 Virus-infected BHK21cells in the No 3 brain tissue

圖3 3號腦組織感染BHK21細(xì)胞與陰性血清反應(yīng)Fig.3 Virus infected BHK21 cellsin theNo 3 brain tissueshow negative serum reaction.

圖4 3號腦組織感染BHK21細(xì)胞與陽性血清反應(yīng)Fig.4 Virus-infected BHK21 cells in theNo 3 brain tissueshow positive serum reaction.

圖5 正常BHK21細(xì)胞在電鏡下的形態(tài)Fig.5 Ultrastructure of normal BHK21 cells

圖6 病毒分離株感染BHK21細(xì)胞在電鏡下的形態(tài)Fig.6 Ultrastructural morphology of virus-infected BHK21 cells

2.2.4 分離株部分核苷酸的鑒定

(1)病毒分離株RNA的提取

3株乙腦分離株、JEV標(biāo)準(zhǔn)株、正常BHK21細(xì)胞，按試劑盒說明書的操作步驟提取病毒3 μL。

(2)乙腦病毒分離株E基因和PrM基因的RT-PCR擴(kuò)增及鑒定

電泳結(jié)果顯示，3株分離株均能擴(kuò)增到約197 bp E基因和519 bpPrM基因的目的條帶，電泳結(jié)果見圖7和圖8。擴(kuò)增到的E基因和PrM基因測序結(jié)果與Genbank JEV序列比較，同源性均在95%～98%之間。

注：M：100 bp DNA Mark；1：JDY1；2：JDY2；3：正常;BHK21細(xì)胞；4：JDY3；5：JEV。圖7 3株分離株E基因擴(kuò)增電泳結(jié)果Note.M: 100 bp DNA marker; 1: JDY1; 2: JDY2; 3: Normal BHK21cells; 4: JDY3; 5: JEV.Fig.7 Electrophoresis results of E gene amplification of 3 isolates

注：M：100 bp DNA Mark；1：JEV；2：JDY1；3：JDY2；4：JDY3；5：正常BHK21細(xì)胞。圖8 3株分離株P(guān)rM基因擴(kuò)增電泳結(jié)果Note. M: 100 bp DNA marker; 1: JEV; 2: JDY1; 3: JDY2; 4: JDY3; 5: Normal BHK21 cells.Fig.8 Electrophoresis results of PrM gene amplification of 3 isolates

(3)乙腦分離株的基因分型

3株分離株與Beijing-1、GB30、Nakayama、SA14-14-2等23株乙型腦炎病毒參考序列的E基因核苷酸進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示核苷酸同源性為95%～99%。3株分離株比較，JDY1和JDY2核苷酸同源性為99%，JDY1和JDY3核苷酸同源性為97%，JDY2和JDY3核苷酸同源性為97%。3株分離株與疫苗株SA14-14-2核苷酸同源性均為95%。

遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果(見圖9)顯示，本次分離的3株新分離株JDY1、JDY2、JDY3與Beijing-1株親緣關(guān)系最近，3株分離株均為GⅢ型乙型腦炎病毒。

3 討論

隨著生物、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，實(shí)驗(yàn)用小型豬的應(yīng)用越來越廣泛。近年來我國實(shí)驗(yàn)用小型豬的開發(fā)利用也在逐年遞增，但大部分小型豬為開放飼養(yǎng)，很難避免由蚊蟲傳播感染疾病，同時JEV對豬的感染也會對實(shí)驗(yàn)人員和飼養(yǎng)人員造成潛在威脅，尤其是乙型腦炎病毒。因此實(shí)驗(yàn)用小型豬JEV預(yù)防控制也受到相關(guān)部門的重視。本實(shí)驗(yàn)用于鑒定的25只小型豬是用于制定北京市小型豬地方標(biāo)準(zhǔn)做本底篩查樣本小型豬的一部分，在樣本采集之前沒有接種過JEV疫苗。實(shí)驗(yàn)室同時對包括被鑒定的25只豬在內(nèi)的共60只小型豬進(jìn)行JEV血清抗體篩查，ELISA和IFA檢測結(jié)果顯示60只小型豬JEV抗體陽性率分別26.7%和28.3%[3，4]，與文獻(xiàn)報道相符(20%～30%)[12]。被鑒定的25只小型豬ELISA和IFA檢測JEV抗體陽性率均為24.0%(6/25)。雖然胡燕等(2006)和楊欣艷等(2007)分別通過血清學(xué)方法對北京小型豬感染JEV進(jìn)行了報道，但并沒有對病毒進(jìn)行分離鑒定[14,15]。本實(shí)驗(yàn)通過病毒分離鑒定和抗體檢測說明北京小型豬確實(shí)存在JEV的感染，同時實(shí)驗(yàn)也為北京市小型豬地方標(biāo)準(zhǔn)的修訂及其不斷完善提供了科學(xué)的參考數(shù)據(jù)。北京市于2011年發(fā)布了地方標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)用小型豬微生物學(xué)等級及監(jiān)測》，將乙型腦炎病毒作為普通級小型豬必須檢測項(xiàng)目[15]，但并沒有對普通級小型豬是否進(jìn)行JEV免疫接種提出要求，只是要求接種疫苗的普通級小型豬在疫苗接種有效期內(nèi)群體免疫合格率達(dá)到70%以上[16]。實(shí)際通過本實(shí)驗(yàn)室近幾年對北京市小型豬JEV的檢測，還有部分豬場沒有定期接種JEV疫苗或者沒有完全按JEV免疫接種程序進(jìn)行接種。定期按免疫程序接種疫苗的豬場，免疫合格率基本均能達(dá)到70%以上。通過本實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[14]和文獻(xiàn)[15]，建議豬場對普通級小型豬進(jìn)行JEV疫苗的免疫接種，既能保障豬群免受JEV感染，也能保障飼養(yǎng)人員與實(shí)驗(yàn)人員的安全。

實(shí)驗(yàn)采用BHK21細(xì)胞培養(yǎng)法從25個小型豬腦組織中分離出3株疑似為JEV的毒株，根據(jù)細(xì)胞病變情況，說明能分離到活的病毒；3株分離株病變細(xì)胞滴片與JEV抗血清能夠產(chǎn)生強(qiáng)綠色免疫熒光反應(yīng)；3株分離株細(xì)胞毒能中和JEV標(biāo)準(zhǔn)抗血清，中和效價均為1：64；3株分離株經(jīng)掃描電鏡形態(tài)鑒定，為直徑約為40nm的有囊膜病毒，符合JEV特征；經(jīng)E基因和Prm基因部分核酸序列分析，與GenBank中JEV核苷酸同源性為95%～99%。充分證明分離到的3株豬源病毒為JEV。

本實(shí)驗(yàn)是國內(nèi)首次從小型豬種群中分離到JEV。通過部分核苷酸序列分析，JDY1、JDY2、JDY3與Beijing-1核苷酸同源性分別為98%、98%和97%，與SA14-14-2 疫苗株核苷酸同源性均為95%。通過E基因遺傳進(jìn)化樹分析3株分離株均為GIII JEV。

圖9 3株新分離乙腦病毒E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.9 Phylogenetic analysis of JEV E gene of three newly isolated strains

通過農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)SA14-14-2減毒疫苗可用于豬乙型腦炎病毒的預(yù)防接種[17]，足見國家對預(yù)防豬乙型腦炎病毒感染的重視。實(shí)驗(yàn)通過對分離到得北京豬源JEV的初步鑒定，證明近年在北京流行的仍然為與SA14-14-2減毒株親緣關(guān)系很近的GIII JEV。進(jìn)一步證明SA14-14-2疫苗可以用于豬感染JEV的預(yù)防接種，不僅對從源頭上控制飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員JEV的感染很有意義，而且對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展也很有意義。

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Isolation and identification of Japanese encephalitis virus in the experimental minipigs

WANG Ji, FU Rui, LI Xiao-bo, WANG Shu-jing,GONG Wei, WEI Li, YUE Bing-fei*,HE Zheng-ming*

(National Institutes for Food and Drug Control, National Center for Quality of Laboratory Animals, Beijing 100050, China)

Objective To understand the characteristics of minipigs infected withJapanese encephalitis virus(JEV).Methods After the brain tissues were treated, the pig brain tissue treatment solution was inoculated with BHK21 cells. Then, virus culture,indirect immunofluorescence assay, neutralization test, electron microscopic observation, and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification of the new isolate E segment and PrM segment nucleotide sequence were performed and the genotype was identified.Results BHK21 cells were inoculated into 25 pigbrain tissues. Among them, three tissue-treated fluid couldinduce shrinkage and aggregation of BHK21 cells, and immunofluorescence staining showed strong green fluorescence response. The results of neutralization test showed that the neutralization titer of these three new isolates was 1:64, and the size of the virus particles was about 40nm under the electron microscope. The homology of both RT-PCR product sequencing results and E-segment of vaccine strain were 95%. Three new isolates were type GIII JEV.Conclusion The results ofthisstudydemonstrate that there is G III type Japanese encephalitis virus infection in the minipig farm.

Japanese encephalitis virus, JEV; Isolation; Identification

王吉(1974-)，女，副研究員，從事微生物學(xué)和免疫學(xué)研究。Email:wj_nd_jds@sina.com

岳秉飛(1960-)，男，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。Email：y6784@126.com 賀爭鳴(1957-)，男，研究員，研究方向：微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail: zhengminghe57@163.com

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A

1671-7856(2017) 03-0057-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.011

2016-07-25