小鼠諾如病毒巢式PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用

趙 娜,王麗媛,趙歆伊,曹福源,陳 松,張艷淑,姚 林,李 爽

(1.華北理工大學(xué)實(shí)驗動物中心,河北 唐山063210;2.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河北 唐山 063210;3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063210)

小鼠諾如病毒(Murine norovirus,MNV)是一種引起免疫缺陷小鼠腦炎、腦膜炎、肝炎、腸和肺炎的與人類諾如病毒密切相關(guān)的傳染性病原[1]。該病毒于2003 年從轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)以及重組體激活基因2(RAG2)缺陷(RAG2-/-/STAT1-/-)小鼠中被首次發(fā)現(xiàn)[2],之后美國、加拿大、日本、韓國等國的實(shí)驗小鼠體內(nèi)均監(jiān)測到該病毒[3-5],并發(fā)現(xiàn)MNV 是感染實(shí)驗動物的重要病原體,幾乎所有的實(shí)驗小鼠對此病毒易感。目前MNV的診斷方法主要為分子生物學(xué)和血清學(xué)方法。RT-PCR 已廣泛應(yīng)用于諾如病毒的檢測,成為諾如病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但由于杯狀病毒科基因組高度變異性,其敏感性及特異性受到一定影響。為了設(shè)計一種高敏感性和特異性的檢測方法,突破目前MNV 檢測局限,本研究通過代表性毒株序列比對,選取MNV 的保守區(qū)序列,建立MNV 巢式PCR 檢測方法,為MNV 感染的分子生物學(xué)診斷提供了一種快速、敏感的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒 感染小鼠諾如病毒、呼腸孤病毒III 型(Reovirus type III)、小鼠輪狀病毒(Mouse rotavirus)、小鼠細(xì)小病毒(Minute virus of mice)、小鼠微小病毒(Mouse parvovirus),小鼠腺病毒(Mouse adenovirus)病料,均由華北理工大學(xué)實(shí)驗動物中心實(shí)驗室檢測并保存。

1.2 主要試劑 ExTaqDNA 聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、Olig dT,購自寶生物工程(大連)有限公司;TRIZol Reagent RNA 提取試劑盒,購自Invitrogen公司;DNA Marker、凝膠回收試劑盒,購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)已發(fā)表的MNV 基因組序列(KF113527、EF014462、HQ317203、EU004670、DQ223041、DQ223042、JX048594),選取MNV 保守區(qū)序列設(shè)計引物,利用Oligo 6.0 生物學(xué)軟件設(shè)計合成了2 對引物,由北京諾賽生物工程有限公司合成。第1 輪擴(kuò)增引物P1：5′-GAGGATGAGTGATGGCGC-3′(5058～5075 bp);P2：5′-TTGAGGGAAGGGATGGGT-3′(5836～5819 bp);第2 輪擴(kuò)增引物P3：5′-GGTGGTTGTTGCCCTTGT-3′(5418～5435 bp);P4：5′-GGCTGTTTGTGCGGAGTG-3′(5635～5618 bp)。

1.4 病毒RNA 提取和cDNA 合成 按TRIZol Reagents 試劑盒操作說明書提取病毒總RNA,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL,總RNA 2 μL,5×Reverse transcriptase Buffer 4 μL,dNTP(2.5 mmol/L)8 μL。RNA 抑制劑0.5 μL,隨機(jī)引物(9 mer)50 pmol,M-MLV 1 μL,DEPC 水補(bǔ)足20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為30 ℃10 min,42 ℃1 h,99 ℃5 min,4 ℃10 min,即合成cDNA 第一鏈。

1.5 巢式PCR 反應(yīng)的建立 巢式PCR 需進(jìn)行2 次PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為50 μL,包括10×ExTaqBuffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)4 μL,上游引物和下游引物(100 pmol/μL)各1 μL,ExTaq酶5 μL,病毒cDNA 第一鏈1 μL,ddH2O 補(bǔ)足50 μL。第1 次PCR 反應(yīng)所用引物為MNV P1 和MNV P2,擴(kuò)增程序如下：98 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,46 ℃退火45 s,72 ℃延伸70 s,30 個循環(huán),再72 ℃延伸10 min,4 ℃終止反應(yīng)。巢式PCR 使用引物MNV P3 和Flay P4,擴(kuò)增程序為：98 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán),再72 ℃延伸10 min,4 ℃終止反應(yīng)。2 次PCR 后進(jìn)行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果在紫外光下進(jìn)行分析。

1.6 序列分析 回收擴(kuò)增產(chǎn)物,送測序公司進(jìn)行測序。利用Clustal W 和Mega 6.0,將測序序列與諾如病毒代表毒株序列進(jìn)行核苷酸同源性分析,驗證產(chǎn)物的特異性。

1.7 巢式PCR 敏感性試驗 使用分光光度計測量MNV 核酸濃度,并換算成拷貝數(shù)。用蒸餾水10 倍稀釋核酸至1×100個拷貝/μL,從1×107個拷貝/μL 開始每個稀釋度取1 μL 為模板,分別采用巢式PCR 和普通PCR 進(jìn)行檢測。

1.8 巢式PCR 特異性試驗 分別提取陽性病料中呼腸孤病毒III 型、小鼠輪狀病毒的RNA 和小鼠細(xì)小病毒、小鼠腺病毒的DNA,用1.5 中建立的巢式PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增,以檢驗體系的特異性。

1.9 巢式PCR 對臨床樣品的檢測 采集野生小鼠的盲腸及其內(nèi)容物加入10 倍PBS(pH 值7.2)進(jìn)行研磨制成勻漿,凍融3 次,8 000 r/min 離心10 min,取上清按TRIZol Reagents(Invitrogen)試劑盒操作說明書提取病毒總RNA,反轉(zhuǎn)錄后用已建立的巢式PCR 進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳,第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物在779 bp、第2 輪擴(kuò)增產(chǎn)物在218 bp處可見特異性DNA 擴(kuò)增條帶(圖1),與預(yù)期大小相符。

圖1 巢式PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 序列分析 將以MNV P3 和P4 為引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,結(jié)果表明6 個樣品序列均為小鼠諾如病毒基因序列。將MNV 基因測序序列與Gen-Bank 公布的其他MNV 代表株相同位置基因進(jìn)行序列比結(jié)果顯示,與毒株BJ 10-2062(KM458057)相似性最高,同源性為98.8%。

2.3 巢式PCR 的敏感性 巢式PCR 的檢測極限為500 個拷貝/μL,而傳統(tǒng)PCR 的有效擴(kuò)增最小量為5×105個拷貝/μL。巢式PCR 的敏感性為普通PCR的1 000 倍(圖2)。

2.4 巢式PCR 的特異性 應(yīng)用建立的巢式PCR 反應(yīng)體系對MNV 和其他對照病原在相同條件下進(jìn)行擴(kuò)增以檢驗體系的特異性。結(jié)果顯示,MNV 巢式PCR 擴(kuò)增片段大小為779 bp 和218 bp,與預(yù)計相符,而其他對照病原均沒有條帶出現(xiàn)(圖3)。

圖2 巢式PCR 敏感性檢測

圖3 巢式PCR 特異性檢測

2.5 巢式PCR 對臨床樣品的檢測 提取30 份樣品的核酸,用建立的巢式PCR 體系進(jìn)行檢測,其中17 份為陽性。陽性產(chǎn)物經(jīng)測序后均為MNV 病毒片斷序列,陽性率為56.67%。

3 討論

自2003 年首次分離到小鼠諾如病毒以來,學(xué)者發(fā)現(xiàn)MNV 具有多種亞型,且核酸與人諾如病毒同樣具有高度變異性。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行檢測,引物的廣譜性對于檢測的敏感、特異性非常關(guān)鍵[6]?；谛∈笾Z如病毒與人類諾如病毒序列的分析,引物設(shè)計位點(diǎn)大多為具有一定保守性的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列作為檢測目的片段。隨著MNV 全基因組序列的測定和分析,發(fā)現(xiàn)在MNV的5′端和ORF1-ORF2 連接位置分別存在32 bp和64 bp 的保守序列。之后,在ORF4 和3′非編碼區(qū)也同樣發(fā)現(xiàn)存在47 bp 和83 bp 的保守序列區(qū),這些保守序列為PCR 診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)[7]。本試驗所用設(shè)計的引物均是針對這一區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,所采用的引物經(jīng)前人研究驗證對不同亞型的MNV 均具有較為理想的檢出率。試驗建立巢式PCR 方法相對于傳統(tǒng)的方法靈敏度更高,特異性好,操作簡單,而且該方法能檢測出病毒載量很低或處于潛伏期的病毒。小鼠諾如病毒巢式PCR 方法的建立有助于發(fā)現(xiàn)和隔離病毒攜帶動物,為進(jìn)一步研制MNV 巢式PCR 檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

流行病學(xué)調(diào)查表明,MNV 在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。2011 年有學(xué)者對歐洲實(shí)驗小鼠MNV 感染情況進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)MNV 感染率高達(dá)58%～64%[8]。2012 年,日本報道野生嚙齒類動物中MNV 感染率為14.9%,感染動物中85.4% 為姬鼠,其余為黑鼠[9]。在我國,袁文等于2010 年首次報道廣東省實(shí)驗小鼠攜帶有MNV,用RT-PCR 的方法檢測206份小鼠盲腸內(nèi)容物,其中MNV 陽性為77 份,陽性率37.38%。各品系小鼠易感性無顯著差異[10]。本試驗對30 份屏障環(huán)境內(nèi)的小鼠樣品進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)陽性率56.67%,該結(jié)果高于袁文等于2010 年報道的廣東省實(shí)驗小鼠MNV 37.38%陽性率,這與巢式PCR 敏感性高于常規(guī)RT-PCR 方法有關(guān)。目前我國對MNV 的流行病學(xué)調(diào)查研究較少,亟需進(jìn)一步了解我國實(shí)驗小鼠MNV 感染情況,加強(qiáng)病毒分子流行病學(xué)研究,為該病毒在實(shí)驗動物飼養(yǎng)管理的防控及分子流行病學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。